皂莢提取物對肝細(xì)胞癌大鼠TGF-β/Smads信號通路調(diào)控和微血管密度的影響*

肝細(xì)胞癌(HCC)是惡性程度較高的腫瘤

。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療肝癌的方法主要有手術(shù)、放療、化療、分子靶向治療、介入治療、動脈化學(xué)栓塞和干擾素、白細(xì)胞介素-Ⅱ、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞等免疫療法

，但成本昂貴，毒副作用較大。中醫(yī)藥對HCC的治療是多角度，多層次的，能抑制腫瘤細(xì)胞生長、提高患者免疫功能、減少并發(fā)癥和毒副作用，具有明顯的治療效果

。

皂莢又名皂角，具有祛除頑痰, 通竅開閉, 祛風(fēng)殺蟲等作用。近年來，關(guān)于中藥皂莢在HCC治療中的應(yīng)用進(jìn)行了很多研究

。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smads信號傳導(dǎo)通路的異?？蓪?dǎo)致肝細(xì)胞生長周期紊亂，促進(jìn)細(xì)胞持續(xù)分裂增殖，導(dǎo)致HCC發(fā)生

。本實驗觀察皂莢提取物(乙酸乙酯提取物)對TGF-β/Smads信號通路中Smad4和Smad7兩個重要蛋白表達(dá)的影響，為皂莢提取物防治HCC提供理論和實驗依據(jù)。

無奈退到客廳，看見車鑰匙在桌上，那女的已經(jīng)說了，我不會開車的。保安說，那怎么辦？那女的兩手一攤，我也沒辦法，我又推不動那車。馮一余只得自認(rèn)倒霉，說，你把車鑰匙給我，我替你開走。那女的還有些不放心，你行嗎？別把我們的車蹭壞了。

在農(nóng)村水電改革發(fā)展實踐中，深刻體會到農(nóng)村水能資源是廣大貧困山區(qū)賴以生存發(fā)展的寶貴資源，農(nóng)村水電開發(fā)必須考慮當(dāng)?shù)厝罕姷年P(guān)切，更多惠及當(dāng)?shù)剞r(nóng)民；必須在規(guī)劃、建設(shè)和運行過程中更加重視保護(hù)生態(tài)環(huán)境，不能以犧牲環(huán)境為代價；必須加強(qiáng)法規(guī)制度建設(shè)，做到依法行政；必須加快改革步伐，健全市場機(jī)制，充分發(fā)揮市場作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

基于設(shè)計的大豆根系L系統(tǒng)，在VC++6.0開發(fā)平臺下，借助OpenGL強(qiáng)大的三維圖形和模型庫進(jìn)行構(gòu)建，系統(tǒng)充分考慮根系間夾角、側(cè)根彎曲度和根系生長量的變化，并采用隨機(jī)函數(shù)實現(xiàn)各量值的隨機(jī)變化，從而使生成的圖形具有更好的視覺效果，隨機(jī)生成的大豆根系拓?fù)淠Ｐ腿鐖D2所示。

1.1.2 大鼠肝癌細(xì)胞來源 H22細(xì)胞的荷瘤昆明種大鼠1只(體重37.5 g，收集腹水時)。

1.1.1實驗動物 昆明種大鼠60只，體重為(20±2)g，雄性，清潔級購于湖北省動物實驗研究中心[合格證號：SCXK(鄂)2020-0005]。本課題實驗動物倫理通過了湖北省中醫(yī)院動物倫理申請委員會的批準(zhǔn)，其編號為：JN.No20190615S0640120[358]。

2.2 6組大鼠MVD表達(dá)情況 見表2。

1.1.4 主要試劑 dNTP、TaqDNA聚合酶、cDNA、上下游引物、ddH等主要試劑均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；ReverTra Ace-α-逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green realtime PCR master mix(TOYOBO公司)；去離子水、TRIzo1 Reagent、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇(購于醫(yī)院藥房)；Rea1-time PCR Detection System(SLAN，HONGSHI)。

1.2 實驗方法

我四歲時，爸媽離婚了。爸爸回了老家，再也沒有出現(xiàn)過，也沒給過一分錢撫養(yǎng)費。盡管如此，媽媽在我面前，卻從不說爸爸任何不是。她總是開朗的、健康的、無堅不摧的，什么問題她都能解決的樣子。

2.1 5組大鼠肝臟組織smad4 mRNA、Smad7 mRNA表達(dá)情況見表1。

1.2.2 實驗方法 將60只大鼠隨機(jī)分為6組：模型組、皂莢提取物高、中、低劑量組(簡稱高、中、低劑量組)、陽性對照組、空白對照組，每組10支。除空白對照組外，其余5組大鼠均在右腋窩皮下接種H22肝癌細(xì)胞懸液0.2 ml造模。造模第2天開始分別給各組大鼠灌胃相應(yīng)藥物：高劑量組大鼠灌胃皂莢提取物26 mg/d(體積0.4 ml)，中劑量組大鼠灌胃皂莢提取物13 mg/d(體積0.4 ml)，低劑量組大鼠灌胃皂莢提取物7.8 mg/d(體積0.4 ml)，陽性對照組大鼠灌胃索拉菲尼7.8 mg/d(體積0.4 ml)，模型組和空白對照組大鼠灌胃等體積的生理鹽水。1次/d，共30 d。造模后第32天處死大鼠，采集標(biāo)本進(jìn)行各指標(biāo)檢測。

1.2.4 微血管密度(MVD)的判斷標(biāo)準(zhǔn) 參照Weidner校正方法，任何被抗體染色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，不管是否形成管腔，只要與周圍的微血管、腫瘤細(xì)胞和其他連接組織有清楚界限，都認(rèn)為是一個可計數(shù)的微血管。先用低倍鏡(×10)在每一個標(biāo)本下選取熱點(5個微血管數(shù)最多的區(qū)域)，然后在每一個熱點中計算一個高倍鏡(×40)下的微血管數(shù)目，取其平均值為MVD值。

1.2.3 smad4 mRNA、Smad7 mRNA檢測 取出肝臟組織,以4%甲醛溶液固定, 修剪組織并沖洗后經(jīng)梯度酒精脫水，石蠟包埋切片(片厚6 μm)、以鼠抗-CD34(1∶50)為第一抗體，EnVision(rat)為第二抗體(均購于Abcam公司，貨號：Ab185732)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。采用Image Pro Plus v6.0 圖像分析軟件進(jìn)行分析。

肝癌的產(chǎn)生、侵襲、轉(zhuǎn)移與體內(nèi)腫瘤新生血管的形成、多種基因的突變、細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路密切相關(guān)

。目前已知與肝癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)的分子通路主要有4條

，其中TGF-β/ Smads信號傳導(dǎo)通路起著非常重要作用。

2 結(jié)果

1.2.1 肝癌細(xì)胞制備 將荷瘤昆明種大鼠頸椎脫臼處死，收集含有H22肝癌細(xì)胞荷瘤大鼠的腹水15 ml, 在湖北省中醫(yī)院實驗室中使用BFX5-320低速離心分離機(jī)提取H22肝癌細(xì)胞, 然后加入無菌注射用水調(diào)整細(xì)胞懸液中腫瘤細(xì)胞濃度至4×10

/L。

1.1.3 索拉菲尼 為北京建生藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，購自醫(yī)院藥房。

3 討論

即使是白內(nèi)障醫(yī)師操作嫻熟，手術(shù)成功，也依然有較多的患者存在持續(xù)3個月的眼表不適，特別是原本存在干眼或眼表疾病的患者。很多研究者認(rèn)為這是由多因素造成的干眼癥的進(jìn)展和惡化[19-21]，這些因素包括術(shù)前結(jié)膜囊消毒液聚維酮碘的化學(xué)刺激、術(shù)中角膜切口對角膜神經(jīng)的破壞、顯微鏡的光毒性、術(shù)中和術(shù)后局部眼科用藥及滴眼液中防腐劑苯扎氯銨的化學(xué)性刺激，術(shù)后炎癥因子的釋放等。

TGF-β細(xì)胞生長、分化可參與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。TGF-β/Smads信號傳導(dǎo)通路是由TGF-β受體、Smads蛋白質(zhì)家族及其細(xì)胞核轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑構(gòu)成的。Smad4和Smad 7作為TGF-β/ Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要分子，在TGF-β受體激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)生基因改變時,阻斷TGF-β信息繼續(xù)向細(xì)胞內(nèi)傳遞,使細(xì)胞增殖失去控制,從而發(fā)生肝細(xì)胞癌變

。

五四時期，除了本土的封建主義意識形態(tài)，附著于各種思潮的西方意識形態(tài)也涌入中國，如功利主義（實用主義）、無政府主義、基爾特社會主義、新村主義，等等，宣揚著各自對社會的見解和主張。在各種主義中，有的標(biāo)榜贊成“共產(chǎn)主義”或“社會主義”，但其內(nèi)容和實質(zhì)卻是偽社會主義或反馬克思主義的，一時讓人難辨真假，阻礙著馬克思主義的科學(xué)社會主義的傳播。馬克思主義與一些反馬克思主義的意識形態(tài)進(jìn)行了較長時間的論戰(zhàn)，比較著名的是與功利主義（實用主義）、基爾特社會主義、無政府主義的論爭。

在Smads信號傳導(dǎo)過程中，Smad4基因被確認(rèn)為腫瘤抑制基因，Smad4與各種不同的Smads蛋白協(xié)同作用，共同發(fā)揮抗癌作用。其水平降低，就會使抑制肝癌的效應(yīng)降低。張宇恒

的研究結(jié)果提示，Smad4低表達(dá)與肝癌的發(fā)生發(fā)展及惡性程度密切相關(guān)，可能在肝癌的啟動、促進(jìn)、發(fā)展或轉(zhuǎn)移等各個階段起著重要作用。而Smad7表達(dá)增強(qiáng)，則有助于腫瘤的發(fā)生，且能促進(jìn)細(xì)胞向惡性化進(jìn)展

。

以索拉菲尼為代表的多靶點激酶抑制劑具有較好的有效性和安全性，可作用于多個靶點，對多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用，它能延長HCC患者生存期,是晚期肝癌患者重要治療藥物

。索拉菲尼不但可以直接阻斷腫瘤細(xì)胞的增殖,還可以抑制血管的新生，故本研究將其作為陽性對照藥物。

肝癌的產(chǎn)生、侵襲、轉(zhuǎn)移與體內(nèi)腫瘤新生血管的形成密切相關(guān)，許多學(xué)者把MVD作為腫瘤新生血管形成的重要標(biāo)志來反映肝癌的生物學(xué)行為

。因此本實驗以MVD的變化來探測皂莢提取物對HCC的防治情況。

近年來，皂莢治療HCC取得一定成果，2005 年美國國立癌癥研究所和香港理工大學(xué)研究發(fā)現(xiàn), 皂莢濃縮液具有抗癌特性，可抑制乳腺癌、肝癌等實體癌細(xì)胞生長

。張振宇等

發(fā)現(xiàn)皂莢提取物對人肝癌細(xì)胞bel-7402的增殖具有顯著抑制作用，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻止腫瘤細(xì)胞無限增殖；研究表明，細(xì)胞增殖周期的調(diào)控與端粒酶活化密切相關(guān)，端粒酶活化有可能是所有惡性腫瘤發(fā)生的一個必經(jīng)之路

。還有實驗發(fā)現(xiàn)，皂莢提取物可以抑制肝癌be-l 7402細(xì)胞端粒酶活性,使抑癌基因活化、促癌基因失活，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡

。汪紅衛(wèi)等

研究結(jié)果證實豬牙皂正丁醇提取物含藥血清，能抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721。

本研究結(jié)果表明,皂莢提取物可明顯提高帶瘤大鼠肝組織中Smad4基因表達(dá)、降低Smad7基因表達(dá)，從而加強(qiáng)TGF-β/ Smads信號傳導(dǎo)通路，起到抗癌作用。究其機(jī)制：①皂莢提取物能增加腫瘤抑制基因的活化和促癌基因的失活起到抗癌作用。②皂莢提取物能夠抑制腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性，加快腫瘤細(xì)胞凋亡。③皂莢提取物能夠減少腫瘤新生血管的生成，減少腫瘤血供抑制腫瘤生長。因此，皂莢提取物可成為治療HCC的有效藥物。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

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