基于16SrRNA技術探討輕微型肝性腦病患者腸道菌群的變化特征*

輕微型肝性腦病(MHE)是以行為異常和意識障礙等為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)功能失調(diào)綜合征，一般由肝功能障礙和(或)門體分流，使內(nèi)源性或外源性毒性代謝產(chǎn)物，未經(jīng)肝臟的代謝清除，導致全身代謝紊亂，屬于肝性腦病(HE)早期階段。MHE的早期發(fā)現(xiàn)和有效干預措施是治療的重點。近年研究表明，腸道微生態(tài)改變與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關

，并且有可能加快MHE患者病情的進展

，而有效地干預和控制腸道菌群失調(diào)有利于延緩和阻止肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展

。本研究通過16S rRNA 技術分析MHE患者腸道菌群豐度及結(jié)構(gòu)變化，為MHE的預防和治療提供理論依據(jù)及思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院肝病?？圃\斷符合乙型肝炎后肝硬化標準、并發(fā)MHE的16例患者為研究對象，另從社會招募10例健康志愿者作為對照組。對照組人員均為健康體檢者，通過病史、體格檢查及胸透、血尿常規(guī)、血糖、肝、腎功能等理化檢查，評定無心、腦、肝、腎、肺等主要器官系統(tǒng)的實質(zhì)性病變。在納入的16例MHE患者中，女6例，男10例，年齡(51.46±8.38)歲。對照組10例，女4例，男6例，年齡(48.26±11.52) 歲。兩組人員在年齡、性別方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義(

>0.05)。課題研究報廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查，批準后實施(倫理編號2018-002-01)。嚴格按本研究知情同意操作規(guī)范進行知情告知。

（2）鑄件驗收標準 鑄件材質(zhì)為G20Mn5+N，是目前軋機機架廣泛使用的材質(zhì)之一，其化學成分要求如附表所示。

1.2 診斷標準

圖4為MFAC-PID和PID仿真比較結(jié)果。從圖4可見： 在設定值階躍響應階段，PID串級控制算法的調(diào)整時間為350 s，其超調(diào)量約為50%；MFAC-PID串級控制算法的調(diào)整時間為250 s，其超調(diào)量為30%。在蒸汽擾動階段，PID串級控制算法的調(diào)整時間大于400 s，其超調(diào)量高達170%；MFAC-PID串級控制算法的調(diào)整時間約為250 s。在給水擾動階段，PID串級控制算法的震蕩回復時間約為250 s，其超調(diào)量約為20%；MFAC-PID算法的調(diào)整時間為200 s，其超調(diào)量為10%。

2.6 差異腸道菌群的微生物群落代謝分析 PCA分析發(fā)現(xiàn)，MHE組樣本主要集中在轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)運蛋白、分泌系統(tǒng)、轉(zhuǎn)運體4個方面(見圖6)。

1.2.2 患者納入標準 ①符合上述診斷標準；②肝硬化Child-Pugh分級均為A或B級；③數(shù)字連接試驗(NCT)及數(shù)字符號試驗(SDT)同時或其中1項異常者。

2.4 腸道菌群差異的關聯(lián)統(tǒng)計分析 我們進行了Spearman分析，將相互拮抗或協(xié)同的物種信息通過網(wǎng)絡構(gòu)建出來(見圖4)。其中腸球菌屬與瘤胃球菌屬、青枯菌屬與布勞特氏菌屬、考拉桿菌屬與放線菌屬呈顯著的負相關關系。

2.3 MHE患者腸道菌群差異在門、綱、目、科、屬水平分類學組成分析 根據(jù)物種注釋結(jié)果，在門的水平兩組樣本間具有統(tǒng)計學差異的菌屬為厚壁菌門和變形菌門；綱水平主要是梭菌綱、紅蝽菌綱和桿菌綱；目水平有乳桿菌目、梭菌目、放線菌目和紅蝽菌目；科水平為毛螺菌科和紅蝽菌科；屬水平則為羅斯伯里氏菌屬、毛螺菌屬、糞球菌屬和韋榮球菌屬(均

<0.05)。為了更加深入探索MHE患者腸穩(wěn)態(tài)菌屬，我們將屬分類水平豐度排名前15的OTU也排列出來，分別有擬桿菌屬、腸球菌屬、糞桿菌屬、布勞特氏菌屬、韋永氏球菌屬、巨單包菌屬、腸桿菌屬、毛螺菌屬、羅斯氏菌屬、普氏菌屬、乳酸菌屬、瘤胃球菌屬、芽殖菌屬、糞球菌屬、鏈球菌屬。見表1。

2.2 MHE患者腸道菌群差異的Beta分析 見圖3。與Alpha分析一致，兩組樣本腸道微生物組成結(jié)構(gòu)存在顯著性差異(

=0.002，

<0.01)。

2 結(jié)果

2.5 差異腸道菌群的微生物群落功能分析 見圖5，表2?？梢钥闯鰞山M樣本在預測功能上存在差異，其中在染色體、氨基酸相關酶、甲烷代謝、精氨酸和脯氨酸代謝功能上存在統(tǒng)計學差異(

<0.05)。

Analysis of the Present Situation and Existing Problems of Dianchi Wetland Park——A Case Study of Wujiadui Wetland Park________________________LI Yuntao 28

1.4 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用

法進行方差齊性檢驗，正態(tài)分布資料的相關性采用

相關系數(shù)，使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。以

<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

那個全禿的亮頭皮的婦人在對面的長炕上類似尖巧的呼叫，她一面走到金枝頭頂，好像要去抽拔金枝的頭發(fā)。弄著她的胖手指：

1.3 研究方法 采用Invitrogen DNA Mini Kit提取腸道宏DNA，使用熒光計儀對DNA進行定量，E-Gel 電泳系統(tǒng)檢驗核酸完整性。對DNA進行16SrRNA擴增與純化，具體操作根據(jù)Gillevet和Hamady相關實驗方法

；KEGG代謝路譜分析是在QIIME軟件中以97%相似性水平上挑選OTU序列，輸出腳本，使用PICRUSt軟件在KEGG通路水平輸出代謝功能豐度。

2.1 MHE患者腸道菌群差異的Alpha分析 見圖1。圖1顯示(Control組表示對照組，treatment B/treatment before組為MHE組，下同)，隨樣本量增加，兩組樣本Alpha曲線趨于平緩，表明樣本量已足以反映物種群落的豐富度等變化情況。但對照組樣本曲線達到反映該物種群落的豐富度所需要的測序深度較MHE組高，說明MHE組樣本物種的豐富程度較低。就微生物群落而言，MHE組樣本Chao1指數(shù)與Shannon指數(shù)均顯著降低(

<0.01)，說明MHE組樣本腸道微生物群落豐富度和多樣性顯著減少；另外MHE組樣本Shannon箱型圖個體間離散程度較對照組明顯，提示MHE組樣本腸道菌群結(jié)構(gòu)個體差異較大，見圖2。

1.2.1 乙型肝炎后肝硬化診斷標準 16例患者診斷符合中國中西醫(yī)結(jié)合學會消化系統(tǒng)專業(yè)委員會制定的肝硬化中西醫(yī)結(jié)合診療共識中的標準

。

3 討論

肝臟作為人體最大的代謝器官，通過將膽汁酸釋放到膽道和全身與腸道溝通循環(huán)。而在腸道中宿主和腸道菌群代謝內(nèi)源性和外源性產(chǎn)物通過食道靜脈支流被帶入肝臟門靜脈，由此腸-肝雙向關系形成。一個完整的“腸-肝-腦軸”依賴于穩(wěn)定的腸道粘膜屏障、健康的腸道菌群以及正常的肝臟功能，原因第一是腸道上皮細胞可形成物理屏障阻礙細菌侵入腸道黏膜，作為連接天然免疫與適應性免疫應答的橋梁

；第二是當屏障破壞后，肝臟不僅是腸道逃逸細菌的被動接受者，而是能積極控制它們進入體循環(huán)的途徑

，所以腸道菌群與肝臟疾病有著緊密關系。雖然己知腸道微生態(tài)對控制MHE進程有重要作用，但是具體的作用機制及相關菌群結(jié)構(gòu)、功能和代謝變化仍不完全清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，在門的水平對照組樣本糞便菌群中絕大多數(shù)序列隸屬于擬桿菌門和厚壁菌門，兩菌門序列約占總序列數(shù)90%，是腸道菌群中的絕對優(yōu)勢菌。與對照組相比，MHE組患者厚壁菌門細菌比例顯著減少，差異主要來自隸屬于厚壁菌門中的梭菌綱和桿菌綱；進一步分析發(fā)現(xiàn)毛螺菌科中羅斯氏菌屬、毛螺菌屬、糞球菌屬相較于對照組明顯降低，而韋榮球菌屬細菌較對照組卻顯著升高。其中韋榮球菌屬為MHE的潛在致病菌，屬于人類口腔定植菌之一，可沿著消化道異位定植到腸道后發(fā)揮協(xié)同作用，誘發(fā)加重肝性腦病病情

。研究發(fā)現(xiàn)其致病過程主要是通過發(fā)酵乳酸引起的 pH 降低導致丁酸的生長速率受抑，間接促進腸黏膜促炎細胞因子表達并產(chǎn)生內(nèi)毒素影響腸道免疫

；同時通過增加氨的產(chǎn)生導致細微或明顯的肝性腦病，使患者認知能力下降，MELD評分升高

；不僅如此，還發(fā)現(xiàn)它的增加與體內(nèi)內(nèi)皮激活和膽汁代謝有關

。而在屬水平排名前15中的差異菌群中腸球菌屬也為MHE潛在致病屬，其中腸球菌屬在MHE患者腸道粘膜含量升高和克雷伯氏菌屬肝硬化患者糞便含量升高已被實驗所證實

；同時腸球菌屬和腸桿菌屬是與體內(nèi)炎癥感染相關的病原菌，其炎癥反應可能開啟血腦屏障導致毒素進入大腦，這與大多數(shù)MHE關系密切

。毛螺菌屬、羅氏菌屬、糞球菌屬的作用則與韋榮球菌屬呈相反態(tài)勢，它們被稱為有益菌屬，主要參與丁酸鹽的產(chǎn)生

。相關研究證實毛螺菌屬、羅氏菌屬、糞球菌屬可通過將碳水化合物分解為短鏈脂肪酸(SCFAs)的方式參與丁酸鹽的產(chǎn)生，進而抑制肝臟中的膽固醇及低密度脂蛋白的生物合成

；而丁酸鹽是上皮細胞的主要能量來源，可通過調(diào)節(jié)腸道pH、抑制核因子信號通路、促進黏蛋白和抗菌肽的產(chǎn)生，同時通過增強腸上皮細胞的完整性來增強腸屏障功能，減少促炎因子及細胞黏附分子的表達

。相關證據(jù)顯示

，這3種腸道菌屬與腸道氨水平、體內(nèi)相關炎癥和內(nèi)皮激活呈負相關，而與良好認知能力、腸道IgA水平和腸道免疫力呈正相關，對肝性腦病的發(fā)展有很好的抑制作用。在前15種差異菌屬中糞桿菌屬、布勞特氏菌屬也皆與丁酸鹽的正常產(chǎn)生相關。另外，隸屬于放線菌門的紅蝽菌綱、紅蝽菌目、紅蝽菌科升高具有統(tǒng)計學意義。其中紅蝽菌與多不飽脂肪酸、血清膽固醇和甘油三酯代謝密切相關，表明該菌屬變化可能與MHE患者內(nèi)源性脂質(zhì)代謝有關

。

由此可見，民間俗信作為一種流動的生活文化現(xiàn)象，它是一種以民眾為主體在進行著動態(tài)的傳承，故其內(nèi)涵與象征意義必然會受到不同時代人們的生活形態(tài)、信仰心理的影響，而有所質(zhì)變。張光直在討論神話與當代文化社會關系時曾經(jīng)說過：

后續(xù)的物種相互關聯(lián)分析我們發(fā)現(xiàn)存在相互抑制信息的菌屬，其中腸球菌屬與瘤胃球菌屬之間負相關關系符合我們之前的討論，它們在丁酸鹽的產(chǎn)生上呈相反作用；青枯菌屬和放線菌屬在腸道內(nèi)多數(shù)易引起感染，促進炎癥反應發(fā)生，而與其呈負相關的布勞特氏菌屬和考拉桿菌屬則能發(fā)揮抗炎作用，與全身性炎癥細胞因子顯著相關

。所以我們推測在MHE患者腸道中腸球菌屬、青枯菌屬和放線菌屬可能導致腸道丁酸鹽產(chǎn)生下降、氨水平上升和炎癥反應來誘發(fā)MHE的發(fā)生，而與其呈相互抑制的菌屬有望成為治療的切入靶點。另外，KEGG預測群落功能顯示在染色體、氨基酸相關酶、甲烷代謝、精氨酸和脯氨酸代謝功能上存在顯著差異，表明MHE發(fā)生、發(fā)展進程可能與其腸道菌群功能變化存在關系；進一步KEGG PCA分析中我們發(fā)現(xiàn)MHE組樣本在轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)運蛋白、分泌系統(tǒng)、轉(zhuǎn)運體4個方面差異的貢獻值較高，提示MHE患者腸道菌群代謝途徑可能通過這4個途徑參與MHE發(fā)病。

綜上所述，MHE患者存在菌群結(jié)構(gòu)失衡的主要特征為在門、綱、目、科、屬中有益菌減少、致病菌增長以及腸道內(nèi)各菌屬之間的比例失調(diào)，功能主要是在染色體、氨基酸相關酶、甲烷代謝、精氨酸和脯氨酸代謝上存在差異，并且可能通過轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)運蛋白、分泌系統(tǒng)、轉(zhuǎn)運體等途徑參與MHE發(fā)病。新近多數(shù)研究表明腸道菌群微生態(tài)與肝性腦病的發(fā)生、發(fā)展和控制有著密切關系，失調(diào)的菌群通過移位、加重炎癥反應和內(nèi)毒素水平等促進MHE的病理進展過程，最后導致患者認知水平和MELD評分加重。所以本研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)和功能失調(diào)菌屬以及菌屬相關代謝信息可作為MHE患者腸道菌群失衡狀態(tài)及進展風險的有效評估項目，為MHE的治療提供新的方向和依據(jù)。但同時該研究也存在不足，首先是未能將MHE疾病進展分期與腸道菌群多樣性、結(jié)構(gòu)和功能代謝進行比對；其次是組間結(jié)構(gòu)和功能差異菌屬雖然可能是導致MHE的關鍵菌屬，但并不代表所包含菌屬都對MHE的腸道群落結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響，簡而言之，細致到每個菌屬在MHE疾病層面具體的作用機制還有待更加深入全面的研究。

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