妊娠早期胎盤絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流與早期自然流產(chǎn)的相關(guān)性

張伊，王洪，張志坤，張騏，謝擎，王昕妍，張印峰

母胎循環(huán)與胎兒發(fā)育及母體妊娠并發(fā)癥息息相關(guān)。胎盤作為母胎循環(huán)的主要器官，其解剖結(jié)構(gòu)和生理特點(diǎn)仍有待進(jìn)一步探索。既往相關(guān)研究多局限于解剖及組織學(xué)層面，隨著超聲技術(shù)不斷發(fā)展，對(duì)胎盤無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的觀察已經(jīng)實(shí)現(xiàn)。3D多普勒超聲已被應(yīng)用于評(píng)估母胎界面[1-2]，但其精確性和可重復(fù)性仍存爭(zhēng)議[3]。近年來(lái)，超微血流成像（superb microvascular imaging，SMI）[4]及SlowflowHD[5]等技術(shù)的出現(xiàn)，使超聲精細(xì)化觀察胎盤血流成為可能。本研究團(tuán)隊(duì)此前使用HD-Flow及SlowflowHD模式觀察自然妊娠女性胎盤絨毛區(qū)時(shí)發(fā)現(xiàn)，臍帶插入點(diǎn)下方的胎盤絨毛血流信號(hào)在整個(gè)胎盤血流中往往較為突出，最早可于孕4+5周檢出，此時(shí)該信號(hào)位于卵黃囊下方絨毛區(qū)，且其長(zhǎng)度與孕齡、血清人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）水平及頭臀長(zhǎng)相關(guān)[6]。本研究將該血流信號(hào)暫命名為“絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流”，并進(jìn)一步探究其與胚胎早期發(fā)育及早期自然流產(chǎn)的關(guān)系，為胚胎及胎盤早期發(fā)育提供新的影像學(xué)證據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象納入2020年9月—2021年2月在天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院（我院）生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）術(shù)后14 d（相當(dāng)于孕4周）血清hCG≥25 U/L的女性。根據(jù)IVF-ET常規(guī)方法計(jì)算孕齡：卵裂期（Day3）胚胎移植按照移植日期前17 d、囊胚（Day5）移植按照移植日期前19 d開(kāi)始計(jì)算。我院生殖醫(yī)學(xué)中心對(duì)通過(guò)IVF-ET妊娠的女性常規(guī)分別于孕5周、孕7周及孕12～13周進(jìn)行超聲檢查。排除患高血壓、糖尿病、免疫系統(tǒng)疾病及既往不良妊娠史者（復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、妊娠合并糖尿病和妊娠期高血壓）后，693例女性于孕5周開(kāi)始行超聲檢查，確認(rèn)單胎妊娠的508例女性于孕7周及孕12～13周行超聲檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：超聲確認(rèn)異位妊娠或雙胎妊娠；退出、失訪或未在研究規(guī)定時(shí)間參加超聲檢查。研究對(duì)象的納入排除過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1 研究對(duì)象納入排除過(guò)程

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集利用我院生殖醫(yī)學(xué)中心電子病歷信息系統(tǒng)獲取研究對(duì)象年齡、妊娠前體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、不孕原因和時(shí)間、基礎(chǔ)性激素水平（月經(jīng)周期第3～5天）、移植胚胎類型（新鮮胚胎或凍融胚胎）和孕4周時(shí)及孕5周行超聲檢查當(dāng)日、孕7周行超聲檢查當(dāng)日的血hCG水平等信息。孕5周超聲下可見(jiàn)孕囊定義為臨床妊娠。由我院生殖醫(yī)學(xué)中心醫(yī)護(hù)人員對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行妊娠期隨訪，記錄是否發(fā)生流產(chǎn)及流產(chǎn)原因等。孕12周以內(nèi)發(fā)生自然流產(chǎn)定義為早期自然流產(chǎn)，未發(fā)生早期自然流產(chǎn)定義為持續(xù)妊娠。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2.2 超聲檢查研究對(duì)象分別于孕5周（5～5+6周）、孕7周（7～7+6周）、孕12～13周（12～13+6周）3個(gè)時(shí)間段在我院超聲科接受常規(guī)超聲檢查。孕5周和孕7周采取經(jīng)陰道超聲掃查，使用GE Voluson E10超聲設(shè)備和RIC6-12-D探頭；孕12～13周采取經(jīng)腹部超聲掃查，使用GE Voluson E8超聲設(shè)備和RM6C探頭。操作由經(jīng)驗(yàn)豐富的高年資醫(yī)師完成，另有一名有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師在旁協(xié)同判定。確認(rèn)卵黃囊（孕5周未見(jiàn)胎芽時(shí)）與臍帶插入位置（孕7周及孕12～13周）后，局部放大其附近絨毛區(qū)并開(kāi)啟HD-Flow使取樣框置于目標(biāo)區(qū)域，使用HD-Flow調(diào)節(jié)焦點(diǎn)遠(yuǎn)離胚胎。調(diào)節(jié)多普勒流速標(biāo)尺至0.9 cm/s（孕5周）、2 cm/s（孕7周）和4 cm/s（孕12～13周），囑孕婦短暫屏住呼吸，并使用壁運(yùn)動(dòng)濾波器以過(guò)濾雜波，在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)找到最接近卵黃囊或臍帶插入點(diǎn)下方絨毛區(qū)一條走行長(zhǎng)直、兩端分別連接絨毛膜板和基板的血流信號(hào)，輕輕變換探頭角度以確認(rèn)其存在和走向。在該信號(hào)顯示最完整的切面，以其接近孕囊的端點(diǎn)為起點(diǎn)，位于絨毛區(qū)和蛻膜交界處該信號(hào)與螺旋動(dòng)脈交界的端點(diǎn)為終點(diǎn)，測(cè)量?jī)牲c(diǎn)之間的距離作為絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)的長(zhǎng)度（見(jiàn)圖2），隨后采集該血流信號(hào)絨毛膜板及基板處血流頻譜，測(cè)量時(shí)根據(jù)具體情況進(jìn)行角度校正（使其小于20°）。觀察過(guò)程中嚴(yán)格遵循合理可行最低劑量（As Low As Reasonably Achievable，ALARA）原則[7]，依照標(biāo)準(zhǔn)[8-10]嚴(yán)格控制聲輸出功率與焦點(diǎn)和取樣框深度，以確保熱指數(shù)和機(jī)械指數(shù)在規(guī)定安全范圍內(nèi)（均小于0.7），且絨毛區(qū)接受多普勒超聲時(shí)間總計(jì)不超過(guò)1 min。

圖2 各孕周絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)長(zhǎng)度測(cè)量

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SAS 9.4統(tǒng)計(jì)軟件及R 4.1.2對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。正態(tài)分布的定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的定量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。定性資料采用例（百分比）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。結(jié)合早期自然流產(chǎn)組中該絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)長(zhǎng)度的分布情況，選擇不同孕齡絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)長(zhǎng)度的第5百分位數(shù)作為界值，采用Logistic回歸分析孕5周、孕7周時(shí)絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)長(zhǎng)度在低于第5百分位數(shù)與早期自然流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。雙側(cè)檢驗(yàn)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線特征最終納入本研究分析的493例女性中，83例發(fā)生早期自然流產(chǎn)（自然流產(chǎn)組），410例持續(xù)妊娠（持續(xù)妊娠組）。2組的年齡、妊娠前BMI、吸煙與飲酒比例、孕次、產(chǎn)次、不孕因素、不孕時(shí)間、移植胚胎類型和移植胚胎質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），基礎(chǔ)雌二醇（estradiol，E2）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）、催乳素（prolactin，PRL）、睪酮（testosterone，TTE）、抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）和促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）差異亦均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。持續(xù)妊娠組孕4周時(shí)及孕5周超聲檢查當(dāng)日、孕7周超聲檢查當(dāng)日血hCG水平顯著高于自然流產(chǎn)組（均P＜0.001）。見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象基線特征

2.2 2 組胚胎發(fā)育情況比較持續(xù)妊娠組孕5周孕囊徑及卵黃囊徑大于自然流產(chǎn)組，孕7周孕囊徑、卵黃囊徑、胎芽和胎心率均大于自然流產(chǎn)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)表2。持續(xù)妊娠組在孕12～13周超聲檢查中頭臀長(zhǎng)為65.80（62.30，69.70）mm，胎心率為162.67（158.67，167.00）次/min。

表2 2組胚胎孕5周及孕7周發(fā)育情況 [M（P25，P75）]

2.3 絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流與其下方螺旋動(dòng)脈特征

2.3.1 2組絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)在不同孕周的超聲表現(xiàn)孕5周和孕7周持續(xù)妊娠組優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)檢出率及該血流信號(hào)長(zhǎng)度均大于自然流產(chǎn)組（P＜0.05）；2組優(yōu)勢(shì)血流頻譜類型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），均以靜脈樣頻譜占比最高。孕5周持續(xù)妊娠組螺旋動(dòng)脈阻力指數(shù)（resistance index，RI）低于自然流產(chǎn)組（P＜0.05），2組下方蛻膜區(qū)血流頻譜類型、優(yōu)勢(shì)血流靜脈流速和螺旋動(dòng)脈收縮期峰值流速（peak systolic velocity，PSV）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表3。孕7周持續(xù)妊娠組螺旋動(dòng)脈PSV大于自然流產(chǎn)組（P＜0.05），2組下方蛻膜區(qū)血流頻譜類型、優(yōu)勢(shì)血流靜脈流速和螺旋動(dòng)脈RI差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表4。持續(xù)妊娠組孕12～13周超聲檢查時(shí)，該優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)檢出率為100%，長(zhǎng)度為13.80（12.10，15.60）mm，胎盤絨毛膜板靜脈均測(cè)得靜脈樣頻譜，流速為4.30（3.90，4.90）cm/s；基板處均可測(cè)得螺旋動(dòng)脈頻譜，PSV為27.30（19.80，39.20）cm/s，RI為0.46（0.40，0.54）。對(duì)不同孕齡絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)長(zhǎng)度、優(yōu)勢(shì)血流靜脈流速及下方蛻膜區(qū)螺旋動(dòng)脈參數(shù)繪制散點(diǎn)圖，可見(jiàn)2組該血流信號(hào)長(zhǎng)度、優(yōu)勢(shì)血流靜脈流速和下方螺旋動(dòng)脈PSV隨孕齡增加而增長(zhǎng)，螺旋動(dòng)脈RI隨孕齡增加而下降。見(jiàn)圖3。

表3 2組絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)在孕5周的超聲表現(xiàn)

表4 2組絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)在孕7周的超聲表現(xiàn)

2.3.2 絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)與早期自然流產(chǎn)的關(guān)系分析絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)長(zhǎng)度在各百分位數(shù)下與自然流產(chǎn)的關(guān)系顯示，孕7周時(shí)，優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)長(zhǎng)度＜P25和P25～P50的孕婦早期自然流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)比優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)長(zhǎng)度≥P75的孕婦高。自然流產(chǎn)組優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)長(zhǎng)度多分布在研究對(duì)象總體的第5百分位數(shù)以下（見(jiàn)圖3A），以血流信號(hào)長(zhǎng)度第5百分位數(shù)為界值將研究對(duì)象分為＜P5組和≥P5組，校正年齡、BMI、胚胎質(zhì)量等混雜因素后結(jié)果顯示，孕7周時(shí)＜P5組發(fā)生早期自然流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)是≥P5組的10.84 倍（OR=10.84，95%CI：6.12～19.22，P＜0.001）。孕5周優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)長(zhǎng)度每縮短1 mm，早期自然流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)增加41%（趨勢(shì)性檢驗(yàn)P=0.014）；孕7周優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)長(zhǎng)度每縮短1 mm，早期自然流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)增加2.42倍（趨勢(shì)性檢驗(yàn)P＜0.001）。見(jiàn)表5。

圖3 絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)各參數(shù)隨孕齡變化散點(diǎn)圖

3 討論

3.1 實(shí)現(xiàn)超聲對(duì)妊娠早期胎盤循環(huán)發(fā)育的觀察本研究在對(duì)接受IVF-ET并成功獲得單胎妊娠女性的檢查中發(fā)現(xiàn)，臍帶插入部位下方絨毛區(qū)存在一條貫穿于絨毛膜板和基板的血流信號(hào)。繼之前對(duì)來(lái)我院就診的自然妊娠婦女胎盤絨毛區(qū)的超聲研究[6]后，再次證實(shí)了該血流信號(hào)的存在。

通過(guò)測(cè)量絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)頻譜發(fā)現(xiàn)，該血流信號(hào)主要呈靜脈樣頻譜，流速隨孕周增加而增長(zhǎng)。持續(xù)妊娠組該血流信號(hào)下方螺旋動(dòng)脈PSV隨孕周增加呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，RI呈下降趨勢(shì)，該結(jié)果符合胎盤絨毛不斷發(fā)育并植入母體蛻膜對(duì)螺旋動(dòng)脈進(jìn)行侵襲重鑄的過(guò)程[11]。自然流產(chǎn)組絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流靜脈流速與持續(xù)妊娠組相似，但其下方蛻膜區(qū)螺旋動(dòng)脈PSV在觀察孕周略低于持續(xù)妊娠組（孕7周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），而RI偏高（孕5周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），推測(cè)可能是胚胎絨毛植入較淺、對(duì)下方螺旋動(dòng)脈重鑄不足所致，并最終導(dǎo)致早期流產(chǎn)。

3.2 對(duì)經(jīng)典理論的證實(shí)與新的發(fā)現(xiàn)胚泡植入時(shí)，成胚細(xì)胞所在端為胚胎極，此處通常最先陷入子宮內(nèi)膜，形成植入極，滋養(yǎng)層細(xì)胞在此優(yōu)先生長(zhǎng)并最終形成胎盤[12]。胎盤作為母胎循環(huán)器官，由母體-胎盤循環(huán)和胎盤-胎兒循環(huán)組成[13]。母體-胎盤循環(huán)結(jié)構(gòu)形成時(shí)間大約為孕4～5周（受精后2～3周），此時(shí)子宮螺旋動(dòng)脈被絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵入，血液流入絨毛間隙[11]。胚泡內(nèi)的成胚細(xì)胞進(jìn)一步分化為包括卵黃囊在內(nèi)的各種胚胎結(jié)構(gòu)，自妊娠第6周，卵黃囊、體蒂及尿囊一起被卷縮形成臍帶[11]。本研究在孕5周卵黃囊下方發(fā)現(xiàn)的絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流，進(jìn)一步證實(shí)了植入極滋養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的優(yōu)先性，此時(shí)正值三級(jí)絨毛形成及胚胎原始心跳出現(xiàn)的時(shí)期[13]。孕7周后觀察該血流常位于臍帶插入點(diǎn)下方，此處絨毛區(qū)最接近胚胎，該優(yōu)勢(shì)血流的存在可能標(biāo)志著胚胎植入母體子宮的位置及最早母胎循環(huán)的建立，其長(zhǎng)度可代表胎盤絨毛發(fā)育程度。本研究發(fā)現(xiàn)，該血流在早期自然流產(chǎn)組明顯縮短，且顯著增加早期自然流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步說(shuō)明了該血流信號(hào)的存在及其對(duì)于預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育的重要性：其長(zhǎng)度過(guò)短，提示滋養(yǎng)細(xì)胞在侵入母體蛻膜過(guò)程中遇到障礙，障礙可能來(lái)自母體（如蛻膜發(fā)育異常、母體疾病等）或胚胎本身，這需要未來(lái)更深入的研究證明；其下方螺旋動(dòng)脈RI增高，提示此時(shí)已出現(xiàn)母胎循環(huán)阻力增加，不排除血管發(fā)育和血管重鑄障礙。

部分研究證明，妊娠早期胚胎絨毛在重鑄螺旋動(dòng)脈過(guò)程中會(huì)堵塞螺旋動(dòng)脈，維持胚胎絨毛的低氧環(huán)境利于其侵襲生長(zhǎng)，至約孕3個(gè)月時(shí)解除[14-15]，但螺旋動(dòng)脈是否會(huì)完全阻塞以及解除阻塞的具體時(shí)間尚存爭(zhēng)議[16]。另外部分學(xué)者對(duì)妊娠早期胚胎絨毛血管觀察后認(rèn)為，孕第5周末（受精后第3周末）絨毛血管初步形成，此時(shí)其內(nèi)尚無(wú)血細(xì)胞[12]。本研究通過(guò)多普勒原理可清晰捕獲到絨毛區(qū)流動(dòng)信號(hào)，在排除偽影等干擾后可觀測(cè)其與螺旋動(dòng)脈的連接以及頻譜特征，對(duì)于該信號(hào)來(lái)自絨毛血管還是絨毛間隙僅通過(guò)超聲技術(shù)目前尚不能證實(shí)，還需顯微技術(shù)層面觀察。但本次觀察結(jié)果提示孕5周末絨毛區(qū)便可出現(xiàn)血流信號(hào)，符合以往部分超聲觀察結(jié)果[17-18]。

3.3 本研究的優(yōu)勢(shì)及局限性本研究在接受輔助生殖治療獲得妊娠的女性中進(jìn)行觀察，能夠準(zhǔn)確計(jì)算胚胎受精后的時(shí)間，為該血流信號(hào)長(zhǎng)度分析提供了準(zhǔn)確的時(shí)間標(biāo)尺。利用電子病歷信息系統(tǒng)獲取研究對(duì)象詳細(xì)的基本特征及治療信息，并由專業(yè)醫(yī)護(hù)人員進(jìn)行跟蹤隨訪，確保基線資料的準(zhǔn)確性。利用HD-Flow超聲技術(shù)，在妊娠早期胚胎、胎盤發(fā)育的觀察中充分發(fā)揮了其無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)、在體的優(yōu)點(diǎn)；觀察位置明確，可重復(fù)性高。但本研究也存在一定局限性。首先，由于妊娠早期絨毛結(jié)構(gòu)細(xì)微，觀察難度較大，需要更為精細(xì)的操作，不排除對(duì)于子宮呈水平位或個(gè)別腹壁極厚者顯像不清導(dǎo)致信息偏倚的可能；其次，超聲觀察屬于間接觀察，故尚不能確認(rèn)該血流信號(hào)的組織來(lái)源及超微結(jié)構(gòu)，期待組織學(xué)層面的證據(jù)；此外，由于隨訪時(shí)間及數(shù)據(jù)的限制，本研究中未能分析該血流信號(hào)與妊娠并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)及更遠(yuǎn)期的妊娠結(jié)局（如是否早產(chǎn)、活產(chǎn)兒出生體質(zhì)量等）之間的相關(guān)性，有待未來(lái)進(jìn)一步完善。

3.4 妊娠早期超聲的安全性分析目前無(wú)明確證據(jù)表明妊娠期超聲檢查會(huì)對(duì)胚胎造成損害[19-21]。美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)（The American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）、美國(guó)超聲醫(yī)學(xué)會(huì)（The American Institute of Ultrasound in Medicine，AIUM）、國(guó)際婦產(chǎn)科超聲學(xué)會(huì)（The International Society of Ultrasound in Obstetrics and Gynecology，ISUOG）和中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)超聲醫(yī)師分會(huì)等在2009—2016年發(fā)布的指南均肯定了妊娠期超聲檢查（包括妊娠早期超聲檢查）的安全性，并強(qiáng)調(diào)ALARA原則[20-23]。本研究在操作過(guò)程中嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)指南建議并遵循ALARA原則，不會(huì)對(duì)胚胎安全性造成損害。

綜上所述，本研究利用HD-Flow超聲技術(shù)從孕5周便可清晰觀察到卵黃囊下方胎盤絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流信號(hào)，其長(zhǎng)度及其下方血流頻譜參數(shù)對(duì)早期自然流產(chǎn)有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，由于其與著床位置密切相關(guān)，對(duì)于異位妊娠的判斷、病理妊娠的預(yù)測(cè)將有重大意義。隨著對(duì)胚胎理論研究的不斷深入和理解、其他方法學(xué)研究的跟進(jìn)，“妊娠早期絨毛區(qū)優(yōu)勢(shì)血流”有望得到進(jìn)一步證實(shí)，可為臨床提供極大幫助，并為胚胎學(xué)基礎(chǔ)理論、母胎界面分子生物學(xué)研究開(kāi)拓新角度并奠定影像學(xué)基礎(chǔ)。