骨形態(tài)發(fā)生蛋白9在門靜脈性肺動脈高壓中的作用機制

張瑞華，秦婷婷，邵玥明,2，張 雨,1b，溫曉玉

1 吉林大學第一醫(yī)院 a.肝膽胰內(nèi)科，b.小兒內(nèi)分泌遺傳代謝科，長春 130021； 2 上海市(復(fù)旦大學附屬)公共衛(wèi)生臨床中心 感染與免疫科，上海 201508

肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PAH)是由多種病因及發(fā)病機制所致的肺血管結(jié)構(gòu)或功能改變，引起肺血管阻力和肺動脈壓力升高的臨床和病理生理綜合征，繼而發(fā)展為右心衰竭，甚至死亡。肺部病理學特征是血管壁中內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞增殖導(dǎo)致小肺動脈狹窄和閉塞[1]，肺血管阻力升高進而導(dǎo)致嚴重PAH。應(yīng)用現(xiàn)有治療方法后平均無移植3年生存率仍只有60%～70%[2-3]。門靜脈性肺動脈高壓(portopulmonary hypertension，POPH)是在門靜脈高壓(伴或不伴慢性肝病)基礎(chǔ)上出現(xiàn)肺動脈壓力升高。2018年，第六屆世界肺高血壓會議[4]將POPH歸為1類PAH(1類PAH指特發(fā)性、遺傳、藥物和毒素誘導(dǎo)、新生兒綜合征、具有肺靜脈閉塞性疾病或肺毛細血管血管瘤病以及與以下內(nèi)容相關(guān)的PAH：結(jié)締組織病、門靜脈高壓癥、先天性心臟病、血吸蟲病等)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(bone morphogenetic protein 9，BMP9)，也稱為生長分化因子2 (growth differentiation factor 2，GDF2)[5]，其作為內(nèi)皮細胞保護因子及血管穩(wěn)態(tài)因子，通過其自身及受體和下游效應(yīng)物參與PAH及POPH發(fā)病，現(xiàn)將BMP9信號通路及其在PAH及POPH發(fā)病中的作用等方面的研究進展作一總結(jié)。2016年國際肝移植學會實踐指南[6]指出：將POPH根據(jù)右心導(dǎo)管測定的平均肺動脈壓(mean pulmonary artery pressure，mPAP)進行分級，可分為輕度(25 mmHg≤mPAP<35 mmHg)、中度(35 mmHg≤mPAP<45 mmHg)和重度(mPAP≥45 mmHg)。

1 POPH流行病學及其發(fā)病機制

1951年Mantz和Craige[7]發(fā)現(xiàn)了第1例POPH。POPH發(fā)病率低，不同研究中其發(fā)病率不同，在PAH中占5%～10%[8]，在門靜脈高壓患者中占1%～2%[9]，即使在肝移植患者中也僅占2%～6%[10]。

由于POPH發(fā)病率低，臨床相關(guān)樣本量少及與之相關(guān)的動物模型建立困難，其發(fā)病機制尚不清楚。目前研究考慮其發(fā)病機制主要有以下幾種。(1)晚期肝病患者門靜脈高壓，其高動力循環(huán)及外周血管阻力降低，導(dǎo)致肺循環(huán)血流增加，肺動脈遭受剪切應(yīng)力增加，造成肺血管內(nèi)皮受損，進而原位血栓形成、血管內(nèi)皮細胞增殖，肺動脈壓力進行性升高[11]。(2)血管活性物質(zhì)失調(diào)：內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞對血管緊張度的調(diào)節(jié)是由平衡的血管擴張劑(如前列環(huán)素和一氧化氮)和血管收縮劑[包括內(nèi)皮素(endothelin，ET)1]介導(dǎo)的。肝臟合成、分解代謝功能受損以及門靜脈高壓引發(fā)各種血管功能障礙級聯(lián)反應(yīng)，從而影響肺部血管系統(tǒng)[12]。門靜脈高壓引起的門體分流允許局部產(chǎn)生或積累的血管活性化合物繞過肝臟進入不同的血管。此外，腸道微生物群及其相關(guān)的具有強血管活性、內(nèi)皮靶向性和細胞毒性特性的雙產(chǎn)物的變化可進一步使血管功能障礙復(fù)雜化和擴散，從而破壞TGFβ、前列腺素、ET、一氧化氮或血管內(nèi)皮生長因子信號通路，ET-1、IL-1、IL-6等引起血管收縮物質(zhì)增加，一氧化氮、前列環(huán)素等引起血管舒張物質(zhì)減少[13]，PAH形成與這種平衡向過度肺血管收縮的轉(zhuǎn)變有關(guān)。(3)氧化應(yīng)激：POPH患者氧化應(yīng)激程度升高，抗氧化系統(tǒng)失調(diào)[14]。(4)雌激素：性別對PAH發(fā)展有影響，根據(jù)潛在疾病病理，女性與男性之比約為4∶1[15]。Sehgal等[16]提出物種特異性雌性(“更連續(xù)型”)與雄性(“脈動型”)循環(huán)生長激素水平的時間模式，解釋了為什么女性比男性更易患PAH；Al-Naamani等[17]研究發(fā)現(xiàn)POPH患者尿液中16α羥基雌酮及血漿16α羥基雌二醇升高，其通過促進增殖、促炎及氧化應(yīng)激等促進肺血管重塑，證實了雌激素信號通路與POPH密切相關(guān)。(5)免疫性因素：自身免疫性肝病患者POPH風險增加[18]。(6)遺傳易感性：遺傳性PAH是常染色體顯性疾病，在高危人群中外顯率低(平均20%～30%)。研究[19]發(fā)現(xiàn)攜帶骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體(bone morphogenetic protein receptor，BMPR)2突變患者更容易發(fā)生PAH，疾病更嚴重，死亡更快。相關(guān)研究[20-21]表明，遺傳性PAH患者BMP9及其受體和下游效應(yīng)物存在功能缺失突變，在此基礎(chǔ)上Nikolic等[22]發(fā)現(xiàn)POPH患者血漿BMP9較其他原因的PAH患者明顯減低，當BMP9血漿濃度低于132 pg/mL時，BMP9對識別POPH具有較高敏感度及特異度。因此，BMP9信號通路獲得性缺失可能也參與POPH發(fā)病。

2 BMP9結(jié)構(gòu)、生理表達及其作用

BMP屬于TGFβ超家族，首次被發(fā)現(xiàn)是在骨和軟骨形成中起重要作用[23]。目前在已知BMP調(diào)節(jié)早期發(fā)育、器官發(fā)生和細胞分化的各個方面，作為成熟組織體內(nèi)平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑發(fā)揮更廣泛的作用。目前已知人類有15個BMP配體，其中僅BMP9與BMP10具有高序列相似性。雖然BMP9在2000年首次報道[24]，但直到2007年2項研究[25-26]同時報道BMP9是激活素受體樣激酶(activin receptor-like kinase,ALK)1的高親和力配體，優(yōu)先作用于血管內(nèi)皮細胞，抑制血管生成并賦予血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，方才引起人們的廣泛關(guān)注。

與其他BMP相似，BMP9合成429個氨基酸的前體(pre-pro-BMP9)，包含22個氨基酸的信號肽，297個氨基酸的前結(jié)構(gòu)域和110個氨基酸的成熟蛋白[5,27]。然后，該前體被絲氨酸內(nèi)切蛋白酶切割以產(chǎn)生成熟的蛋白質(zhì)二聚體(25 kD)，該二聚體可以與2個前結(jié)構(gòu)域(每個33 kD)保持非共價結(jié)合，形成100 kD的復(fù)合物[28](圖1)。當與前結(jié)構(gòu)域復(fù)合時，成熟BMP9二聚體仍保持其生物活性[28-29]。結(jié)合的前結(jié)構(gòu)域被認為增強了BMP9在體內(nèi)的穩(wěn)定性。100 kD循環(huán)前BMP9復(fù)合物中約有60%被切割并具有活性，而其余40%未加工，可通過局部furin蛋白酶切割而被激活[28]。BMP9表達存在組織特異性，其主要在肝臟[24,30]中被檢測到，在肺[30]和大腦[5,31]中也有較低水平表達。

注：BMP9合成429個氨基酸前體，包含22個信號肽，297個前結(jié)構(gòu)域和110個成熟蛋白，該前體被絲氨酸內(nèi)切蛋白酶切割產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)二聚體，該二聚體與兩個前結(jié)構(gòu)域保持非共價結(jié)合，形成100 kD復(fù)合物。

BMP9具有廣泛的生物學功能，包括葡萄糖穩(wěn)態(tài)與胰島素抵抗、脂肪形成、血管生成、神經(jīng)發(fā)生、腫瘤發(fā)生、淋巴管成熟及成骨等作用(圖2)，其中BMP9作為一種血清靜止因子，可抑制內(nèi)皮細胞增殖和血管形成。Scharpfenecker等[25]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用BMP9可有效抑制堿性成纖維生長因子刺激的細胞生長，但對細胞增殖未見影響。同時，研究發(fā)現(xiàn)BMP9完全消除血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)的管狀結(jié)構(gòu)形成，表明BMP9是體外血管生成的有力抑制劑。Park等[32]發(fā)現(xiàn)人肺動脈血管內(nèi)皮細胞(human pulmonary artery endothelial cell，HPAEC)中生理濃度BMP9可通過Smad1和p38 MAPK介導(dǎo)顯著刺激ET-1釋放，進而抑制內(nèi)皮細胞遷移，其中ET-1是由21個氨基酸組成的多肽，是血管收縮劑和有絲分裂原[33]。同時，BMP9可作為內(nèi)皮細胞保護因子維持內(nèi)皮完整性。趨化因子(C-C基序)配體2(CCL2)是參與單核巨噬細胞趨化的關(guān)鍵趨化因子，Upton等[34]在實驗中發(fā)現(xiàn)BMP9依賴ALK1、活化素受體Ⅱa型(Activin receptor-Ⅱa,ACTR-Ⅱa)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體Ⅱ型(BMPR-Ⅱ)抑制人肺動脈內(nèi)皮細胞和主動脈內(nèi)皮細胞CCL2的基礎(chǔ)表達和釋放。Chen等[35]研究了支氣管肺發(fā)育不良和PAH中的BMP9信號傳導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)BMP9能夠改善異常肺泡發(fā)育，還減少了肺部炎癥和血管外膠原沉積，而對正常的新生兒肺部發(fā)育未見負面影響。

圖2 BMP9生理作用

3 BMP9/ALK1/BMPR-Ⅱ/Endoglin/Smad信號通路

BMP9/ALK1/BMPR-Ⅱ/Endoglin/Smad信號通路在調(diào)節(jié)血管形成與穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮著重要作用，ALK1是TGFβ/BMP家族蛋白的Ⅰ型受體，也是肝臟非實質(zhì)細胞中BMP9的主要受體[36-37]。BMPR-Ⅱ是TGFβ信號傳導(dǎo)途徑的成員，其介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)在維持內(nèi)皮完整性及屏障功能方面至關(guān)重要[38]。BMPR2功能缺失突變是PAH最常見的遺傳原因[39]，肺血管BMPR-Ⅱ表達減少是遺傳性和特發(fā)性PAH特征[40]。BMPR2突變已在約70 %家族性PAH和高達25 %散發(fā)性PAH中得到證實[41]。內(nèi)皮糖蛋白(Endoglin)也被稱為CD105，是一種跨膜蛋白，具有較大的胞外域和富含絲氨酸/蘇氨酸的胞質(zhì)區(qū)，其不能單獨結(jié)合配體，但可以作為輔助受體，在Ⅰ型或Ⅱ型信號傳導(dǎo)受體存在下結(jié)合BMP9。已知ALK1或內(nèi)皮糖蛋白突變是引起遺傳性出血性毛細血管擴張癥的主要遺傳原因，并且在遺傳性出血性毛細血管擴張癥類綜合征患者中也報告了罕見的BMP9變異[42]。Smad蛋白家族包含8種蛋白，可被分為3個亞族：調(diào)節(jié)性Smad(R-Smad)，共同性Smad(Co-Smad)，抑制性Smad(I-Smad)。其中，Co-Smad可與R-Smad結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，而I-Smad下調(diào)Smad活化調(diào)節(jié)受體穩(wěn)定性從而抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[43]。BMP9是半胱氨酸結(jié)同源二聚體生長因子，是作用于內(nèi)皮細胞的主要BMP配體[26]，其通過與2個Ⅰ型受體(ALK1)和2個Ⅱ型受體(包括BMPR-Ⅱ、ACTR-Ⅱa和/或Ⅱb)形成復(fù)合物發(fā)揮作用。當BMP9結(jié)合后，Ⅱ型受體組成型活性絲氨酸-蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化并激活Ⅰ型受體，激活的I型受體磷酸化下游底物蛋白R-Smad的C端，一旦R-Smad磷酸化便進一步與共同性受體Smad4形成復(fù)合物，最終轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)進而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。

4 BMP9信號通路參與PAH及POPH發(fā)病的作用機制

因POPH與其他形式PAH之間組織病理學相似，故POPH發(fā)病機制多來源于對PAH的研究?；贐MP9保護內(nèi)皮細胞和維持血管穩(wěn)態(tài)的作用，國內(nèi)外研究人員針對BMP9信號通路及其與PAH乃至POPH的相關(guān)性進行了一系列研究工作(圖3)。2016年，Wang等[44]報道了1例罕見BMP9純合無義突變，突變中第26位氨基酸從谷氨酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止子，BMP9過早截斷導(dǎo)致功能喪失，研究者認為正是這種BMP9功能喪失，降低了BMPR-Ⅱ及ALK1的表達，并破壞了其與內(nèi)皮糖蛋白的相互作用，從而導(dǎo)致PAH發(fā)病，其中無義突變的純合性解釋了該患者為何早期發(fā)病及發(fā)病的嚴重程度。GDF2基因編碼BMP9，Hodgson等[45]通過對一個歐洲PAH患者隊列進行功能分析發(fā)現(xiàn)了GDF2基因罕見破壞性突變，大多數(shù)突變導(dǎo)致成熟蛋白質(zhì)的細胞加工改變和分泌減少，進而導(dǎo)致BMP9循環(huán)水平及活性降低。這些發(fā)現(xiàn)支持了突變在PAH病理生物學中的因果作用，并為人類BMP9水平和活性降低促進PAH發(fā)展提供了有力的證據(jù)。

圖3 BMP9在PAH肺血管重塑中作用

然而，在特發(fā)性PAH中BMP9扮演什么樣的角色仍然存在分歧。ET-1作為血管收縮劑和有絲分裂原，其已被證明可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞遷移和血管生成，Star等[46]通過體外研究指出，PAH時BMP9刺激人肺微血管內(nèi)皮細胞釋放ET-1進而導(dǎo)致PAH。在此基礎(chǔ)上，Park等[32]發(fā)現(xiàn)HPAEC中BMP9可通過Smad1和p38 MAPK介導(dǎo)顯著刺激ET-1釋放，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞小管形成，導(dǎo)致肺血管重塑。上述研究在一定程度上支持BMP9在PAH發(fā)病中的促進作用。此外，研究[47-48]發(fā)現(xiàn)血漿ET-1水平與PAH患者血流動力學嚴重程度呈正相關(guān)，與預(yù)后呈負相關(guān)。近年來隨著對BMP9信號通路的深入了解，越來越多的非遺傳臨床證據(jù)支持BMP9信號減少在PAH發(fā)病中的因果作用[49]。Long等[38]實驗發(fā)現(xiàn)BMP9不僅保護肺動脈內(nèi)皮細胞免于凋亡并促進血管穩(wěn)定性，還增加了BMPR2基因表達及信號傳導(dǎo)，其中BMPR2在維持內(nèi)皮完整性及屏障功能方面有著重要的作用。在體外，BMPR2丟失使HPAEC傾向于凋亡，內(nèi)皮增殖并增加HPAEC單層通透性；在體內(nèi)，BMPR2喪失導(dǎo)致肺血管通透性增加。應(yīng)用重組BMP9直接增強內(nèi)皮BMP信號傳導(dǎo)可以預(yù)防和逆轉(zhuǎn)幾種遺傳和非遺傳臨床前嚙齒動物模型中的PAH，為使用重組配體靶向治療PAH提供了可能性。Dunmore等[50]首次報道了BMPR-Ⅱ依賴溶酶體的降解機制，并通過實驗證實溶酶體抑制劑氯喹可通過抑制BMPR-Ⅱ降解進而增加其水平，同時改善了下游信號傳導(dǎo)。相比之下，Tu等[51]研究發(fā)現(xiàn)，BMP9通過誘導(dǎo)ET-1等因子和抑制腎上腺髓質(zhì)素和apelin等血管舒張因子而賦予血管收縮作用，從而提出選擇性抑制BMP9可部分抑制實驗性PAH。最近又通過對小鼠進行BMP9單基因敲除、BMP9+BMP10雙基因敲除，發(fā)現(xiàn)BMP9基因敲除減弱了慢性缺氧誘導(dǎo)的肺小動脈肌化，且BMP9缺陷小鼠ET-1明顯下降[52]，從而進一步驗證了其之前的結(jié)論。

通過上述研究，可以明確BMP9參與了PAH發(fā)病。那么，既然POPH作為1類PAH的一部分，那BMP9是否參與了POPH發(fā)?。咳绻麉⑴c了發(fā)病，其在POPH發(fā)病中發(fā)揮了正面還是負面作用？為了尋找答案，Nikolic等[22]對暴露于低氧的小鼠應(yīng)用BMP9配體陷阱ALK1-Fc，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其加劇了小鼠PAH和肺血管重塑，直接證明了BMP9的保護作用，從而提出獲得性BMP9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷可導(dǎo)致PAH。之后其又對POPH及1類PAH的其他病因、2類PAH和3類PAH的BMP9水平進行了測量，發(fā)現(xiàn)POPH患者循環(huán)BMP9明顯減少，同時監(jiān)測BMP9拮抗劑可溶性內(nèi)切酶(sEng)，結(jié)果顯示POPH患者sEng水平更高。通過上述實驗分析，Nikolic提出BMP9是POPH敏感和特異性生物標志物，通過臨床數(shù)據(jù)分析，其又指出BMP9可預(yù)測無移植生存率和肝臟疾病中PAH存在。隨著當前醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，POPH診斷逐漸進入臨床，心電圖、胸片、血氣分析、肺功能、超聲心動圖等對POPH診斷率偏低，而右心導(dǎo)管插入術(shù)作為POPH診斷標準，因其為有創(chuàng)操作，且肝硬化患者凝血功能差，故右心導(dǎo)管插入術(shù)一般不被接受。因此，尋找無創(chuàng)性非侵入性POPH生物標志物是非常有益的。

5 小結(jié)與展望

BMP9作為內(nèi)皮細胞保護因子和血清靜止因子，其抑制內(nèi)皮細胞凋亡、遷移、增殖和維持血管穩(wěn)態(tài)。在上述報道和探索中，BMP9信號通路通過其自身及受體和下游效應(yīng)物參與PAH及POPH發(fā)病機制中的作用已得到證實，然而BMP9參與POPH的具體發(fā)病機制比較復(fù)雜，仍需要進一步研究。由于POPH患病率低，POPH樣本量少導(dǎo)致關(guān)于BMP9信號通路參與POPH發(fā)病機制的研究受限，因此仍需要收集大量樣本進行研究。因POPH通常無特異性表現(xiàn)，臨床醫(yī)生在評估門靜脈高壓患者時，特別對于血氧飽和度<95%或存在呼吸困難、疲乏、胸痛、暈厥、咳嗽明顯患者，應(yīng)及時完善超聲心動圖等相關(guān)檢查，從而早期發(fā)現(xiàn)POPH，隨著包括BMP9信號通路在內(nèi)的POPH發(fā)病機制相關(guān)研究的深入，有望為POPH的治療開辟新路徑。

利益沖突說明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：張瑞華負責課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；秦婷婷、邵玥明、張雨參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；溫曉玉負責擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。