多房棘球蚴分泌物抗原對脂多糖誘導小鼠骨髓來源的樹突狀細胞表型及功能的影響

李文登，李超群，胡 旺，徐 凱，龐明泉，乜 茹，馮浩杰，張占紅，劉處處，樊海寧

青海大學附屬醫(yī)院 肝膽胰外科，青海省包蟲病重點實驗室，西寧 810000

多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis，AE)又稱泡型包蟲病，是由多房棘球蚴絳蟲(echinococcus multilocularis，Em)的幼蟲通過感染動物傳染給人類的一種人畜共患病，在世界范圍內造成嚴重的健康問題，特別是在資源有限的地區(qū)或國家[1]，目前被世界衛(wèi)生組織列為被忽視的熱帶病[2]。AE主要侵犯肝臟，是一種慢性、破壞性的臨床疾病，其生長特征是Em向鄰近器官和組織進行性浸潤性增殖，類似于轉移性腫瘤，晚期可轉移至身體的其他部位，如不及時治療，病死率極高[2-3]。Em之所以能夠長期寄生在宿主體內是其進化成一套完整的免疫調節(jié)系統(tǒng)，能夠調節(jié)機體的免疫微環(huán)境，達到長期寄生的目的。樹突狀細胞(DC)是體內最強的抗原遞呈細胞，在寄生蟲感染的免疫應答和免疫耐受過程發(fā)揮著重要的作用。前期的研究表明[4-5]感染Em的患者體內DC的成熟度降低，抑制抗原信號的遞呈，機體內的初始T淋巴細胞(naive T cell,Tn)不能分化和增殖，因此達不到清除病原體的作用，但具體是Em中哪種物質影響DC的表型和功能還不明確。本研究通過建立脂多糖(LPS)誘導的小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(BMDC)的炎癥模型，檢測不同濃度Em的分泌物抗原(Echinococcus multilocularis secreted antigen，Em-sAg)干預BMDC后，BMDC表達的主要組織相容性抗原復合體Ⅱ(major histocompatibility complex class Ⅱ,MHC-Ⅱ)、共刺激分子CD80、CD86及IL-12p70分泌情況，初步探討Em-sAg對LPS誘導的BMDC的表型和功能的影響，為闡明Em的長期寄生宿主體內及其致病機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級健康C57BL/6J雄性小鼠和BALB/C雄性小鼠分別購自北京華阜康生物科技股份有限公司[生產許可證編號：SCXK(京)2019-0008]和斯貝福(北京)生物科技有限公司[生產許可證編號：SCXK(京)2019-0010]，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準(實驗動物使用許可證分別為110322200101999818和110324210101017771)。

1.2 主要試劑及儀器 小鼠重組粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)購自美國PeproTech公司，RPMI-1640細胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清(FBS)購自美國BI公司，LPS購自美國Sigma公司。異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate，FITC)標記的抗 CD80 抗體(CD80-FITC)、藻紅蛋白 (phycoerythrin，PE )標記的抗CD86抗體(CD86-PE)、別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)標記的抗主要組織相容性復合體Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ，MHC-Ⅱ)抗體(MHC-Ⅱ-APC)均購自美國Thermo公司，PerCP-Cy5.5-CD11c購自TONBO公司。IL-12p70 ELISA試劑盒購自欣博盛科技有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)購自塞維爾科技有限公司，青/鏈霉素購自索萊寶科技有限公司。超凈工作臺購自蘇州凈化設備有限公司，流式細胞儀購自BD公司，正倒置熒光顯微鏡購自ECHO公司。

1.3 Em-sAg的獲取及其濃度測定 將本實驗室保存的蒙古沙鼠(長爪沙鼠)脫臼斷頸處死，浸泡于75%乙醇10 min，無菌超凈臺上逐層解剖皮膚、肌肉組織，分離出腹腔內AE病灶組織，用無菌PBS進行沖洗2～3次，使用80目的濾網進行過濾去除組織碎片，并用0.4% 臺盼藍染色3 min，倒置相差顯微鏡下觀察原頭節(jié)活性和數量，并以2000枚原頭節(jié)/只接種于30只小鼠BALB/C小鼠。3個月后將小鼠脫臼猝死，用1 mL的注射器抽取囊泡內的液體，用0.22 μm的無菌濾頭進行過濾除菌，再用BCA蛋白定量法進行濃度測定，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 小鼠BMDC的提取 按照文獻[6]所述，將C57BL/6J小鼠頸椎脫臼法處死，無菌手術取出所有的股骨和脛骨，超凈臺中用1 mL注射器沿骨髓腔沖出骨髓前體細胞，并用200目尼龍網進行過濾去除組織碎片，用含有1%青鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進行重懸，同時加入200 U/mL重組小鼠GM-CSF，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于第3天進行補液10 mL、第6天和第8天分別半量換液，第10天收集細胞，即為BMDC。用正倒置熒光顯微鏡觀察 BMDC的形態(tài)變化。

1.5 BMDC的鑒定 用500 μL PBS重懸收集的BMDC，向流式管中加入0.625 μL PerCP-Cy5.5-CD11c抗體，同時設置不加抗體的空白組，使用BD流式細胞儀檢測CD11c分子表達水平。

1.6 分組 收集培養(yǎng)的細胞，使用不含GM-CSF的10%FBS培養(yǎng)液稀釋至1×106/mL，接種24孔細胞培養(yǎng)板中，分組如下：Control組(加入等體積RPMI1640完全培養(yǎng)基)、陽性對照組，即LPS組(加入濃度為1 μg/mL的LPS)、LPS+3 mg/mL Em-sAg組、LPS+1.5 mg/mL Em-sAg組、LPS+0.75 mg/mL Em-sAg組、LPS+0.375 mg/mL Em-sAg組，作用24 h后，用1 mL PBS洗2次，分別向不同干預組中的流式管中加入0.625 μL PE-CD86、FITC-CD80、APC-MHC-Ⅱ、PerCP-Cy5.5-CD11c抗體，同時設置不加抗體的空白組，用BD流式細胞儀檢測CD11c、CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子表達水平。

1.7 細胞因子的檢測 收集不同濃度Em-sAg作用BMDC 24 h后的上清液，參考IL-12p70試劑盒說明書，通過酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測上清液中IL-12p70的含量，每個樣本設立 3個復孔，通過波長450 nm進行檢測，所有檢測重復3次。

2 結果

2.1 原頭節(jié)活性檢測 將無菌提取的原頭節(jié)用0.4% 臺盼藍進行染色3 min，計數后得出數量在95%以上，活性良好，可用于動物造模(圖1)。

圖1 原頭節(jié)活性檢測

2.2 Em-sAg的提取 無菌超凈臺中用1 mL的注射器抽取病灶內空泡中的液體，即為Em-sAg。

2.3 小鼠BMDC的生長形態(tài)變化特點 從C57BL/6J小鼠骨髓腔內收集的細胞即為骨髓細胞，呈現單個核細胞，均勻圓形，細胞邊界光滑，均勻懸浮于培養(yǎng)基中(圖2a)，培養(yǎng)至第3天，細胞呈現貼壁生長，體積逐漸增大，細胞膜表面可見少量毛刺樣突起(圖2b)，第6天時，細胞由貼壁生長轉為半懸浮狀態(tài)生長，體積進一步增大，表面毛刺樣突起進一步增加(圖2c)，第8～10天時，大部分細胞表面的可見毛刺樣突起，細胞由半懸浮狀態(tài)轉為完全懸浮狀態(tài)，即為較成熟的DC(圖2d、e)，與相關文獻[7-8]中報道的未成熟的BMDC相符。

注：a，第0天(×20)；b，第3天(×20)；c，第6天(×20);d，第8天(×20)；e，第10天(×20)。

2.4 BMDC純度鑒定 收集小鼠BMDC，用PerCP-Cy5.5-CD11c進行染色，并進行流式細胞術分析，其CD11c的陽性率在70%以上，且每次純度檢測都在70%以上，說明此方法培養(yǎng)可以得到較純的BMDC，符合實驗要求(圖3)。

圖3 流式細胞術鑒定BMDC的純度

2.5 Em-sAg抑制DC表面分子的表達 DC是體內最強的抗原遞呈細胞，且在體內多為未成熟狀態(tài)的DC，受到外界抗原(如LPS、TNFα等)的刺激后，由未成熟狀態(tài)轉變?yōu)槌墒鞝顟B(tài)。為研究Em-sAg對LPS誘導的BMDC成熟度及抗原提呈能力的影響。通過流式細胞術檢測不同濃度Em-sAg與LPS共培養(yǎng)后，其表面分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86的表達情況。多組間單因素方差分析發(fā)現，與Control組相比，LPS組表面的細胞分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ均顯著增加(P值均<0.05)；與陽性對照組相比，LPS+3 mg/mL Em-sAg組、LPS+1.5 mg/mL Em-sAg組、LPS+0.75 mg/mL Em-sAg組、LPS+0.375 mg/mL Em-sAg組中BMDC的 CD80顯著減少(P值均<0.05)，多組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=34.870，P<0.001)；LPS+3 mg/mL Em-sAg組、LPS+1.5 mg/mL Em-sAg組、LPS+0.75 mg/mL Em-sAg組、LPS+0.375 mg/mL Em-sAg組中BMDC的 CD86、MHC-Ⅱ無明顯減少(P值均>0.05)(圖4)。

2.6 Em-sAg抑制炎癥因子IL-12p70的釋放 為進一步評價不同濃度Em-sAg對LPS誘導的BMDC功能的影響，通過ELISA試劑盒檢測Em-sAg聯合LPS誘導DC后分泌的IL-12的水平。結果顯示，不同組間的IL-12的水平差異有統(tǒng)計學意義(F=73.140，P<0.05)。與Control組相比，LPS組刺激后IL-12p70的表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與陽性對照組相比，LPS+3 mg/mL Em-sAg組、LPS+1.5 mg/mL Em-sAg組、LPS+0.75 mg/mL Em-sAg組、LPS+0.375 mg/mL Em-sAg組均可降低IL-12p70的表達量(P值均<0.05)，且Em-sAg濃度越高，降低促炎癥因子IL-12p70表達量越明顯(圖5)。

注：a，流式細胞術檢測不同濃度的Em-sAg干預LPS誘導的BMDC的MHC-Ⅱ、CD80、CD86表達量；b，MHC-Ⅱ、CD80、CD86分子表達的定量分析。與Control組相比，*P<0.05；與陽性對照組相比，**P<0.05。

注：與Control組相比，*P<0.05；與陽性對照組相比，**P<0.05。

3 討論

-AE是一種人畜共患寄生蟲病，其中Em是該病的致病原。全球估計每年新增感染病例17 400例，危害極其嚴重[2,9]。Em以犬類為終宿主，以嚙齒動物為中間宿主，人類多因誤入被Em感染的水源或食物而感染[10]。AE具有全球性分布的特點，主要分布于北半球，超過90%的AE的分布于我國西北一帶，包括青海、寧夏、新疆[11]等地，對當地的畜牧業(yè)和經濟帶來沉重負擔[2,12-13]。AE就診時多屬于晚期，錯過最佳的治療時機，治療方式多以外科手術和長期口服阿苯達唑治療為主，效果不理想。現有報道[14-15]表明，免疫治療在改善寄生蟲病方面的作用越來越明顯，因此研究Em的免疫感染機制可為新的治療方式提供理論基礎。

DC是連接固有免疫和適應性免疫的重要橋梁，被認為是最有效的抗原遞呈細胞。當機體受到外界抗原刺激時(如病毒、細菌、微生物、寄生蟲等)，未成熟的DC能夠吞噬、加工、分化成熟，將抗原信號呈遞給Tn，誘導其活化和增殖，進而發(fā)揮機體免疫應答的效應[16]。研究[17-18]證實，細粒棘球蚴囊液和Em囊液均具有上調BMDC表面吲哚胺 2，3-雙加氧酶表達的能力，繼而誘導T淋巴細胞的“失能”,使機體獲得免疫耐受。為進一步探索Em感染宿主免疫耐受方面的機制研究，本研究選取Em-sAg作為刺激物抗原，通過和LPS誘導的BMDC共同作用探究Em-sAg的作用。結果發(fā)現，Em-sAg可以抑制LPS誘導的BMDC的抗原遞呈功能，與濃度無關，并初步探討了共培養(yǎng)后上清中促炎癥因子IL-12在感染過程中可能發(fā)揮的作用。

Tn的活化需要第一信號和第二信號的共同參與，即MHC-Ⅱ分子和共刺激分子(CD80、CD86)，且DC的這些表面分子的表達量與細胞的抗原遞呈能力成正比。研究[19-20]表明，細粒棘球蚴的抗原B可下調DC表面的 MHC-Ⅱ及CD86、CD80分子，誘導T淋巴細胞的“無能”。本研究也得出相同的結果，表明不同濃度的Em-sAg均可抑制LPS誘導的BMDC表面分子CD80的表達，進而抑制其抗原提呈能力。

現有研究[21]表明，成熟狀態(tài)的DC產生的IL-12可誘導Tn分化為1型輔助T淋巴細胞，后者可分泌IFNγ、IL-2等細胞因子介導細胞免疫應答，有助于機體免疫系統(tǒng)對外界抗原的清除。本研究主要檢測Em-sAg對LPS誘導的BMDC(LPS誘導的BMDC即為成熟狀態(tài)的DC)所分泌細胞因子的變化，結果顯示不同濃度的Em-sAg均可抑制BMDC所分泌的IL-12p70的表達，且Em-sAg的濃度越高，抑制分泌IL-12p70的程度就越明顯。

綜上所述，本研究發(fā)現Em-sAg降低LPS誘導的BMDC表面分子CD80表達，并抑制IL-12p70的分泌。這些研究結果將為闡明Em持續(xù)感染和致病機制提供科學依據，并為后續(xù)新藥靶位的發(fā)現和疫苗研制提供理論和實驗依據。

倫理學聲明：本研究方案于2019年6月12日經由新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過，批號：20190531-03，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：李文登、樊海寧、胡旺負責課題設計，修改論文；李文登、龐明泉負責撰寫論文；龐明泉、徐凱、李超群、劉處處、乜茹、馮浩杰、張占紅參與收集、分析數據；樊海寧、徐凱、劉處處負責指導撰寫文章并最后定稿。