2型糖尿病患者中性粒細(xì)胞趨化功能受損及可能機(jī)制

李林斌，吳冕，楊云稀，邵一鳴，劉璐，黃佳敏，孫炳偉

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院燒創(chuàng)傷中心，江蘇 蘇州 215004)

2型糖尿病是全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)持續(xù)上升[1-2]，感染是其最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。研究表明，2型糖尿病對(duì)某些特定病原體的易感性增加，其中細(xì)菌感染的發(fā)病率最高，如骨髓炎、肺炎或蜂窩織炎[3]，這與患者先天性免疫功能受損有關(guān)[4-5]。中性粒細(xì)胞是先天性免疫細(xì)胞中數(shù)量最多的，且在先天性免疫反應(yīng)中第一個(gè)到達(dá)炎癥部位[6]。2型糖尿病患者血糖升高刺激骨髓增生[7]，引起外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量上升[8]。然而，患者中性粒細(xì)胞數(shù)量升高，抵御病原體的能力沒(méi)有增強(qiáng)，提示患者中性粒細(xì)胞功能不全。本研究針對(duì)中性粒細(xì)胞發(fā)揮固有免疫最基本的趨化功能[9]進(jìn)行分析，旨在為預(yù)防和治療糖尿病患者感染性并發(fā)癥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 倫理聲明

本研究獲南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院(蘇州市立醫(yī)院)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)KL901064)。通過(guò)健康志愿者和2型糖尿病患者的肘靜脈獲取血液樣本，在入組24 h內(nèi)采集血樣。在被納入研究之前，所有參與者收到了書面知情同意書。所有的實(shí)驗(yàn)按照批準(zhǔn)的指南進(jìn)行。

1.2 研究對(duì)象

本研究為橫斷面研究，納入2020年7月至12月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院內(nèi)分泌科住院確診的2型糖尿病患者45例。確診標(biāo)準(zhǔn)為存在典型2型糖尿病癥狀且隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L，或空腹血糖≥7.0 mmol/L，或葡萄糖負(fù)荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L。同期于蘇州市體檢中心招募健康成人志愿者45名?；加懈腥尽准?xì)胞>10×109/L的患者及志愿者排除在外。受試者的臨床特征見(jiàn)表1。

1.3 主要試劑與儀器

Hank平衡鹽溶液(HBSS)、PBS、胎牛血清、RPMI 1640(新西蘭Gbico公司)；Ficoll(瑞典GE公司)；糖基化終產(chǎn)物(AGEs，美國(guó)Abcam公司)；FITC標(biāo)記抗P2X1受體抗體(以色列Alomone公司)；兔源P2X1受體一抗(英國(guó)Biorbyt公司)；FITC標(biāo)記的鏈霉素二抗(中國(guó)BIOSS公司)；IX71熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，F(xiàn)ACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，Zeiss LSM 900共聚焦顯微鏡(德國(guó)蔡司公司)。其他試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

表1 受試者一般資料及臨床信息 n=45

1.4 中性粒細(xì)胞分離

使用含EDTA的采血管收集受試者全血2 mL。1 ∶1加入3%葡聚糖沉降紅細(xì)胞20 min。取上清液，離心10 min(400×g，20 ℃)后用1×HBSS(不含Ca2+、Mg2+)重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液置于3 mL的Ficoll上，離心35 min(400×g，15 ℃)后棄上清液。沉淀用3 mL蒸餾水吹打30 s裂解紅細(xì)胞，加入3 mL 2×HBSS，離心7 min(400×g，20 ℃)。重復(fù)裂解2次后獲得純化的人外周血中性粒細(xì)胞。純化的中性粒細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640重懸備用。

1.5 中性粒細(xì)胞趨化功能分析

使用本課題組改良后的瓊脂糖下趨化模型檢測(cè)中性粒細(xì)胞趨化功能。 將煮沸的瓊脂糖溶液與50% HBSS(含Ca2+、Mg2+)和50% RPMI 1640(含20% 胎牛血清)的培養(yǎng)基混合制成瓊脂糖凝膠。然后用移液管將2.7 mL溶液移入35 mm培養(yǎng)皿中，在室溫下冷卻至凝固。當(dāng)瓊脂糖溶液完全凝固時(shí)，在凝膠中切出直徑3 mm、相距2.8 mm的3個(gè)孔。中間孔填充0.1 μmol/L趨化肽(N-formyl-Met-Leu-Phe fMLP)10 μL，兩側(cè)孔填充1×107/mL中性粒細(xì)胞10 μL。凝膠在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。用IX71熒光倒置顯微鏡在四倍鏡下觀察趨化距離。

為分析趨化圖像，本課題組建立了基于計(jì)算機(jī)視覺(jué)的細(xì)胞趨化分析系統(tǒng)。根據(jù)趨化距離將趨化區(qū)域劃分了3個(gè)區(qū)，Ⅰ區(qū)：<800 μm，Ⅱ區(qū)：800～2 000 μm，Ⅲ區(qū)：>2 000 μm。設(shè)置了3個(gè)參數(shù)評(píng)價(jià)中性粒細(xì)胞趨化功能：趨化距離、趨化細(xì)胞比率、趨化指數(shù)。趨化細(xì)胞比率(%)=(趨化細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%；趨化指數(shù)=(Ⅱ區(qū)+Ⅲ區(qū)細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)。

在趨化干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，用RPMI 1640(含20%胎牛血清)將2型糖尿病患者及健康對(duì)照的血漿配制成90%和20%兩組；將AGEs 配制成0.5、1、2和4 mmol/L；葡萄糖配制成5、12、25 mmol/L，25 mmol/L甘露醇為高滲透壓對(duì)照組；棕櫚酸配制成50、100和200 μmol/L。將處理后的中性粒細(xì)胞(1×107/mL)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h(葡萄糖及棕櫚酸干預(yù)實(shí)驗(yàn)孵育4 h)后用PBS洗滌2次后檢測(cè)趨化功能。對(duì)照組用單純培養(yǎng)基處理。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞表面P2X1受體

取純化的人中性粒細(xì)胞5×105個(gè)(細(xì)胞密度為1×107/mL)，按5 μL/100 μL PBS加入FITC標(biāo)記抗P2X1受體抗體，與中性粒細(xì)胞在4 ℃下避光共孵育1 h，用冷PBS洗滌2次后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.7 免疫熒光檢測(cè)中性粒細(xì)胞膜表面P2X1受體

將棕櫚酸干預(yù)后的中性粒細(xì)胞(2×106個(gè))用冷PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛固定15 min，用0.01% Triton X-100滲透30 min，用5%山羊血清封閉1 h，用1 ∶200兔源P2X1受體一抗4 ℃孵育過(guò)夜后，1 ∶1 000 FITC標(biāo)記的鏈霉素二抗室溫避光孵育1 h。在細(xì)胞核染色過(guò)程中，細(xì)胞與DAPI共孵育30 min。染色后，使用共聚焦顯微鏡觀察中性粒細(xì)胞。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 2型糖尿病患者中性粒細(xì)胞趨化功能受損

與健康對(duì)照相比，2型糖尿病患者中性粒細(xì)胞趨化距離、趨化細(xì)胞比率和趨化指數(shù)均明顯下降(t分別為16.19、17.21、16.76，P均 <0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 2型糖尿病患者中性粒細(xì)胞趨化功能分析

2.2 2型糖尿病患者中性粒細(xì)胞膜表面P2X1受體表達(dá)增加

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與健康對(duì)照比較，2型糖尿病患者中性粒細(xì)胞P2X1受體表達(dá)水平明顯升高(t=7.60，P<0.001)；對(duì)2型糖尿病患者中性粒細(xì)胞趨化距離與P2X1受體表達(dá)作相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.60,P<0.001)。見(jiàn)圖2。

圖2 2型糖尿病患者中性粒細(xì)胞膜表面P2X1受體表達(dá)及與趨化距離的相關(guān)性

2.3 中性粒細(xì)胞趨化功能受損機(jī)制分析

2.3.1 2型糖尿病患者高濃度血漿抑制中性粒細(xì)胞的趨化功能 90%和20%的患者血漿刺激健康對(duì)照中性粒細(xì)胞2 h后，3組趨化距離比較總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=46.75，P<0.001)，90%患者血漿組相較對(duì)照組(單純培養(yǎng)基)和20%患者血漿組能明顯抑制中性粒細(xì)胞趨化功能(P均<0.001)；而90%和20%的健康對(duì)照血漿刺激后，3組趨化距離的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.42，P>0.05)。見(jiàn)圖3。

a：P<0.001，與對(duì)照組相比；b：P<0.001，與20%患者血漿組比較

2.3.2 葡萄糖、AGEs、棕櫚酸干預(yù)后中性粒細(xì)胞的趨化功能 在葡萄糖干預(yù)實(shí)驗(yàn)中以5 mmol/L組為對(duì)照組，12、25 mmol/L組為高濃度葡萄糖組，25 mmol/L甘露醇為高滲透壓對(duì)照組。孵育中性粒細(xì)胞4 h后結(jié)果顯示，4組趨化距離比較總體差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.47，P>0.05)。

以0.5、1、2和4 mmol/L的AGEs干預(yù)健康對(duì)照中性粒細(xì)胞2 h后，結(jié)果顯示5組趨化距離比較總體差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.03，P>0.05)。

以50、100 和200 μmol/L棕櫚酸干預(yù)健康對(duì)照中性粒細(xì)胞4 h后，4組趨化距離比較總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.52，P<0.05), 200 μmol/L組較對(duì)照組明顯抑制中性粒細(xì)胞趨化功能(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

a：P<0.05，與對(duì)照組相比

2.3.3 棕櫚酸促進(jìn)中性粒細(xì)胞P2X1受體高表達(dá) 50、100 和200 μmol/L棕櫚酸干預(yù)健康對(duì)照中性粒細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，4組P2X1平均熒光強(qiáng)度比較總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.96，P<0.05)；與對(duì)照組相比，高濃度棕櫚酸(200 μmol/L)明顯促進(jìn)中性粒細(xì)胞膜表面P2X1受體高表達(dá)(P<0.05)，趨化距離與P2X1表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.67，P<0.05)。200 μmol/L棕櫚酸干預(yù)中性粒細(xì)胞4 h，免疫熒光法檢測(cè)膜表面P2X1受體表達(dá)，結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)一致。見(jiàn)圖5。

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P2X1受體；B：趨化距離與P2X1表達(dá)的相關(guān)性；C：免疫熒光檢測(cè)P2X1受體(×100)。a：P<0.05，與對(duì)照組相比

3 討論

胰島素抵抗是2型糖尿病顯著的病理生理學(xué)特征。研究表明，大多數(shù)胰島素抵抗患者存在肥胖和血脂升高[10-12]，其中肥胖引起的慢性炎癥可能在胰島素抵抗中起到重要作用[13]，炎癥因子通過(guò)脂肪和肌肉組織中的IKKβ/NF-κB 和 JNK 通路促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)生[14]。中性粒細(xì)胞是先天性免疫細(xì)胞中數(shù)量最多的[15]，在抗感染中的作用十分重要，其趨化性是指沿著吸引物或排斥物濃度梯度的方向運(yùn)動(dòng)的性質(zhì)[16]。趨化功能正常是中性粒細(xì)胞定向遷移至感染部位的前提，趨化功能障礙會(huì)造成機(jī)體嚴(yán)重的免疫功能缺陷[17]。本研究結(jié)果表明高濃度棕櫚酸對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化性存在抑制作用，這損害了機(jī)體抵御病原體和對(duì)炎癥的清除功能，導(dǎo)致機(jī)體慢性炎癥發(fā)生，加重了患者胰島素抵抗，對(duì)2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展有一定的推動(dòng)作用。

本研究中，2型糖尿病患者的高濃度血漿能明顯抑制中性粒細(xì)胞趨化功能。2型糖尿病患者因代謝功能紊亂，血漿中血糖、AGEs[18]、棕櫚酸[19]等物質(zhì)明顯升高，這些因素均可能是患者中性粒細(xì)胞趨化功能受損的原因。然而，高濃度葡萄糖不能明顯抑制中性粒細(xì)胞趨化功能。除高濃度葡萄糖對(duì)中性粒細(xì)胞趨化功能無(wú)明顯作用外，另一可能的原因是本實(shí)驗(yàn)干預(yù)時(shí)間較短。葡萄糖是中性粒細(xì)胞的供能物質(zhì)，短時(shí)間的高糖干預(yù)甚至可能是中性粒細(xì)胞趨化作用的有利因素。然而，中性粒細(xì)胞在體外半衰期只有8 h[20]，因此體外實(shí)驗(yàn)很難模擬出2型糖尿病患者體內(nèi)中性粒細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間受到高糖刺激的條件。Collison等[21]證明了中性粒細(xì)胞膜上存在AGEs受體，能與中性粒細(xì)胞結(jié)合并引起胞內(nèi)Ca2+一過(guò)性升高。受此啟發(fā)，本研究使用AGEs干預(yù)中性粒細(xì)胞，但未得出AGEs明顯抑制中性粒細(xì)胞趨化功能的結(jié)論。

本課題組在先前的研究中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)毒素刺激中性粒細(xì)胞后，激發(fā)中性粒細(xì)胞自分泌ATP，順序活化ATP/P2X1/Ca2+信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞骨架肌球蛋白輕鏈異常磷酸化及極性化，最終抑制中性粒細(xì)胞趨化功能[22]。在本研究中，高濃度棕櫚酸明顯抑制中性粒細(xì)胞的趨化功能，促進(jìn)中性粒細(xì)胞表面P2X1受體表達(dá)升高，二者呈負(fù)相關(guān)?？梢?jiàn)棕櫚酸在抑制中性粒細(xì)胞趨化功能方面表現(xiàn)出了類似內(nèi)毒素的作用，同時(shí)又與患者存在的慢性炎癥互為因果。該結(jié)論提示，在2型糖尿病患者感染的防治工作中，血脂代謝異常的負(fù)面影響不容忽視。同時(shí)，中性粒細(xì)胞P2X1受體在延緩2型糖尿病患者疾病進(jìn)程以及治療感染并發(fā)癥中或可作為重要靶點(diǎn)發(fā)揮作用，其對(duì)中性粒細(xì)胞趨化功能的調(diào)控，對(duì)改善2型糖尿病患者的慢性炎癥狀態(tài)具有巨大潛在應(yīng)用前景。

多數(shù)臨床工作者對(duì)中性粒細(xì)胞的關(guān)注僅停留在計(jì)數(shù)上，用于輔助診斷炎癥感染狀態(tài)，而中性粒細(xì)胞最為重要的趨化、殺菌等功能往往被忽視。本研究結(jié)果表明，在2糖尿病患者感染相關(guān)的診療中，相較于感染發(fā)生后的抗感染治療，及早調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，可減輕脂質(zhì)代謝異常對(duì)中性粒細(xì)胞造成的損害，增強(qiáng)患者抗感染能力。

綜上所述，2型糖尿病患者中性粒細(xì)胞趨化功能發(fā)生障礙，棕櫚酸通過(guò)中性粒細(xì)胞P2X1受體抑制中性粒細(xì)胞趨化功能。P2X1受體或可作為一種新的檢測(cè)指標(biāo)和靶點(diǎn)，對(duì)于預(yù)警和治療2型糖尿病患者感染并發(fā)癥具有很好的臨床意義。