半相合細(xì)胞移植對(duì)CT-26結(jié)腸癌荷瘤小鼠的抑瘤作用

顓孫雪梅，周慶，孫茂民

(1. 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇 蘇州 215000； 2. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

結(jié)直腸癌每年造成近70萬(wàn)人死亡，成為世界上第四大致命癌癥，僅次于肺癌、肝癌和胃癌[1-2]。同種異基因干細(xì)胞移植已成為治療實(shí)體瘤如結(jié)直腸癌的有效方法[3-4]。造血干細(xì)胞移植除可治療復(fù)雜的血液系統(tǒng)惡性腫瘤外，還可誘導(dǎo)對(duì)實(shí)體器官移植的耐受[5-6]；但同時(shí)又存在移植物抗宿主等不良反應(yīng)[7-8]。上皮細(xì)胞是移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)的靶細(xì)胞，其中，角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和外分泌腺等產(chǎn)生的腫瘤易受移植物抗腫瘤(graft-versus-tumor, GVT)效應(yīng)影響。在癌癥長(zhǎng)期控制中對(duì)GVT重要性的認(rèn)識(shí)使得部分患者采用非清髓性移植方案，降低了與傳統(tǒng)清髓性移植相關(guān)的發(fā)病率和死亡率[6]。非清髓性半相合細(xì)胞移植方案，即利用受體與供體小鼠有一半相同的基因型來(lái)降低GVHD反應(yīng)強(qiáng)度，同時(shí)延長(zhǎng)GVT反應(yīng)時(shí)間。宿主抗原呈遞細(xì)胞可通過(guò)呈遞腫瘤抗原來(lái)激活輸注的供體淋巴細(xì)胞，從而介導(dǎo)癌細(xì)胞的清除[9]。為解決GVT反應(yīng)伴隨嚴(yán)重的移植物抗宿主等不良反應(yīng)，基于C57BL/6鼠的主要組織相容性分子背景為H-2Kb，CB6F1鼠(BALB/c × C57BL/6雜交)為H-2Kb/d，本研究以皮下種植BALB/c小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞建立小鼠皮下荷瘤模型來(lái)評(píng)估半相合細(xì)胞移植的抗結(jié)腸癌效果。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞與試劑

18只BALB/c小鼠[合格證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0043]，40只C57BL/6小鼠[合格證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0006]，6～8周齡，體質(zhì)量為24～28 g，購(gòu)自蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。18只CB6F1小鼠在蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF動(dòng)物室繁殖，所有小鼠均飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》，并經(jīng)蘇州大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

BALB/c小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基和雙抗(美國(guó)Gibco公司)；ELISA試劑盒(碧云天試劑公司)；H-2Kb流式抗體和H-2Kd流式抗體(美國(guó)Abcam公司)；HE染色試劑盒(索萊寶科技有限公司)；環(huán)磷酰胺(源葉生物科技有限公司)。

1.2 皮下荷瘤小鼠模型構(gòu)建及半相合細(xì)胞移植

1.2.1 供體小鼠脾細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的獲取 取40只C57BL/6小鼠，脫頸處死后75%乙醇浸泡 2 min；取小鼠脾和下肢分別放入含有PBS的培養(yǎng)皿中。取脾臟剪碎并研磨，將研磨液轉(zhuǎn)移至200目的細(xì)胞篩網(wǎng)中過(guò)濾；用PBS沖洗篩網(wǎng)2次；4 ℃離心棄上清液；加入2 mL紅細(xì)胞裂解液4 ℃靜置10 min；加入10 mL PBS終止裂解；離心棄上清液，PBS洗滌2次，即得到小鼠脾細(xì)胞。

取小鼠下肢用眼科鑷分離皮膚和肌肉，獲取小鼠脛骨和股骨，用紗布將脛骨和股骨處肌肉去除干凈，剪去兩端軟骨暴露紅色骨髓腔，1 mL無(wú)菌注射器吸取PBS反復(fù)沖洗2～3次，沖洗液后續(xù)處理同上述小鼠脾細(xì)胞，即得小鼠骨髓細(xì)胞。

1.2.2 荷瘤模型構(gòu)建 選取18只健康CB6F1小鼠，隨機(jī)均分為3組，即對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組和移植組，每組6只，均皮下注射5×106個(gè)CT-26結(jié)腸癌細(xì)胞(0.2 mL)，即為受體小鼠。7 d時(shí)可檢測(cè)到小鼠腫瘤體積，表明模型構(gòu)建成功。

1.2.3 半相合細(xì)胞移植 對(duì)照組于小鼠尾靜脈注射0.2 mL生理鹽水；環(huán)磷酰胺組注射0.2 mL環(huán)磷酰胺；移植組在2 d時(shí)先注射0.2 mL環(huán)磷酰胺，以后注射0.2 mL 5×107個(gè)脾細(xì)胞+2×107個(gè)骨髓細(xì)胞；2次/周，連續(xù)注射4周；于移植后2、7、12、17、23、28 d時(shí)測(cè)量小鼠腫瘤體積。

2周時(shí)對(duì)照組小鼠荷瘤過(guò)大死亡；環(huán)磷酰胺組和移植組分別處死3只取其腫瘤組織、肝臟、小腸和皮膚行后續(xù)HE染色和ELISA檢測(cè)等。

1.3 HE染色觀察組織病理變化

取移植2周時(shí)3組小鼠肝臟、皮膚、小腸及腫瘤組織，石蠟包埋，切片4～6 μm；二甲苯脫蠟3次，每次7 min；乙醇梯度水化，無(wú)水乙醇、95%乙醇和75%乙醇各3 min；自來(lái)水沖洗1 min；蘇木精染色2 min；自來(lái)水沖洗5～10 min；1%鹽酸乙醇分化 3 s；自來(lái)水終止分化；1%伊紅染液染色20 s；自來(lái)水沖洗；梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4 ELISA法檢測(cè)腫瘤組織中炎性因子水平

分別取3組小鼠腫瘤組織，加入組織勻漿緩沖液研磨，離心取上清液。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入微孔板中孵育1.5 h后洗滌3次，于各孔中加入稀釋好的生物素化抗體 (IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α和TGF-β) 工作液100 μL孵育1 h；洗去未結(jié)合的生物素化抗體；每孔加入HRP結(jié)合的鏈—霉親和素，室溫孵育20 min；洗滌2次；每孔加入TMB溶液100 μL，室溫避光孵育20 min；終止顯色，待顏色從藍(lán)色變?yōu)辄S色時(shí)于450 nm處測(cè)量光密度值。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血嵌合比率

于移植3 d，2周和4周時(shí)取未處死的同樣3只移植組小鼠眼球血80 μL，加入紅細(xì)胞裂解液2 mL避光4 ℃孵育10 min；PBS洗滌2次，加入抗H-2Kb、H-2Kd抗體避光室溫孵育30 min；PBS洗滌2次；加入200 μL PBS，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血嵌合率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 半相合細(xì)胞移植抑制腫瘤生長(zhǎng)

移植2 周時(shí)對(duì)照組小鼠荷瘤過(guò)大死亡，環(huán)磷酰胺組和移植組小鼠腫瘤體積明顯小于對(duì)照組(P均<0.01)；移植2、7、12、17、23 d時(shí)，移植組小鼠腫瘤體積小于環(huán)磷酰胺組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；移植28 d時(shí)，移植組腫瘤體積顯著小于環(huán)磷酰胺組(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

a: P<0.01，與對(duì)照組比較； b: P<0.01，與移植組比較；A：移植2周時(shí)各組小鼠腫瘤體積比較(n=3)； B：不同時(shí)間點(diǎn)兩組小鼠腫瘤體積比較(n=3)；C：移植4周時(shí)兩組小鼠腫瘤體積(n=3)

2.2 受體鼠的移植物抗宿主反應(yīng)

HE染色結(jié)果顯示，移植組肝組織匯管區(qū)淋巴細(xì)胞數(shù)少于環(huán)磷酰胺組，且組織排列整齊，未見(jiàn)明顯分離；移植組腸黏膜完整，且淋巴細(xì)胞數(shù)少于環(huán)磷酰胺和對(duì)照組；移植組皮膚無(wú)明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分上皮細(xì)胞壞死，另外兩組皮膚組織有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和基底層空泡樣病變。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠肝臟、小腸和皮膚組織HE染色結(jié)果(scale bar=100 μm)

2.3 半相合細(xì)胞移植改變腫瘤部位的免疫微環(huán)境

HE染色結(jié)果顯示(圖3)，移植2周時(shí)，與環(huán)磷酰胺組和對(duì)照組相比，移植組小鼠腫瘤組織浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞數(shù)增多。與對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺組腫瘤相關(guān)因子含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；與對(duì)照組和環(huán)磷酰胺組相比，移植組腫瘤組織中IL-2、IL-10、IFN-γ與TNF-α含量明顯增高(P均<0.05)，IL-4和TGF-β 含量明顯降低(P均<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖3 各組小鼠腫瘤組織HE染色(scale bar=100 μm)

2.4 供體來(lái)源的淋巴細(xì)胞參與GVT反應(yīng)

與移植3 d時(shí)相比，移植2、4周時(shí)移植組CB6F1小鼠外周血中H-2Kb所占比例顯著增加(P均<0.01)。見(jiàn)圖5。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)移植組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血嵌合率

3 討論

產(chǎn)生GVT和GVHD的主要原因是白細(xì)胞抗原不匹配[11]。因此本研究采用皮下種植CT-26結(jié)腸癌細(xì)胞的小鼠作為研究模型，采用骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞靜脈注射非清髓治療的方法，結(jié)果顯示4周時(shí)移植組結(jié)直腸腫瘤體積顯著小于環(huán)磷酰胺組，由此表明，先注射環(huán)磷酰胺降低小鼠免疫力，再進(jìn)行半相合細(xì)胞移植具有明顯的、長(zhǎng)期的移植物抗結(jié)直腸癌效應(yīng)。研究表明，GVHD反應(yīng)與小鼠肝、小腸和皮膚組織有關(guān)[12-13]。本研究HE染色結(jié)果顯示，移植組中GVHD反應(yīng)顯著改善，由此表明免疫原性降低的半相合細(xì)胞移植對(duì)結(jié)直腸癌的治療效果良好。

免疫環(huán)境由腫瘤白細(xì)胞的浸潤(rùn)程度、功能狀態(tài)和組織所決定，可反映患者預(yù)后、治療反應(yīng)預(yù)測(cè)等相關(guān)信息[14-15]。本研究結(jié)果顯示，移植組小鼠移植后2周腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞數(shù)顯著增加，提示半相合細(xì)胞移植可以重塑腫瘤微環(huán)境。研究表明，IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α和TGF-β細(xì)胞因子含量與腫瘤微環(huán)境相關(guān)[15]。 IFN-γ和IL-2屬于Th1型細(xì)胞因子，可促進(jìn)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，促進(jìn)NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化，發(fā)揮抗腫瘤作用[16]。IL-4和IL-10屬于Th2型細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞或嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。TNF-α是由免疫細(xì)胞分泌的具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤退行性變化的細(xì)胞因子[17]。本研究結(jié)果顯示，與環(huán)磷酰胺組相比，移植組IL-2、IL-10、IFN-γ與TNF-α細(xì)胞因子含量顯著升高，IL-4和TGF-β表達(dá)水平明顯降低，由此表明移植組小鼠腫瘤免疫微環(huán)境得到改善，半相合細(xì)胞移植可增強(qiáng)腫瘤的免疫應(yīng)答。研究表明，供者細(xì)胞比例越高，移植物抗腫瘤效應(yīng)越強(qiáng)[18-19]。本研究結(jié)果顯示，移植后2、4周移植組小鼠H-2Kb 所占比例較3 d時(shí)顯著增加 ，表明半相合細(xì)胞供者來(lái)源的骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞參與GVT效應(yīng)。

綜上所述，半相合細(xì)胞移植后靜脈注射環(huán)磷酰胺可誘導(dǎo)長(zhǎng)期免疫耐受，降低GVHD反應(yīng)的同時(shí)改善了抗結(jié)腸癌的作用時(shí)間和強(qiáng)度，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。