日本結(jié)縷草ZjHY5的克隆、亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄自激活檢測

馬 媛， 楊卓雄， 董 笛， 李舒文， 晁躍輝， 許立新

(北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院， 北京 100083)

光作為重要環(huán)境因子之一通過光受體顯著的影響植物種子萌發(fā)、幼苗脫黃化、器官發(fā)育、開花和種子發(fā)育等發(fā)育過程，植物的生長和繁殖取決于植物光合作用所獲得的能量[1]。光質(zhì)、光強以及光照時間的差異都能對植物的光形態(tài)建成造成影響[2]。為了感知環(huán)境中的光刺激，植物發(fā)展出了復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。不同的光感受器可以通過對核心信號網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步協(xié)調(diào)特定的激素和代謝信號通路來調(diào)節(jié)植物的生長和發(fā)育[3]。植物萌發(fā)過程中，幼苗的子葉封閉，抑制根的生長，并增強下胚軸的伸長來推動莖分生組織向上生長，從而突破土壤表層，引發(fā)光形態(tài)建成及暗適應(yīng)(Dark-adapted)向光適應(yīng)(Light-adapted)的轉(zhuǎn)變[4]。植物在生命周期中經(jīng)歷光環(huán)境的轉(zhuǎn)變時(即植物由暗適應(yīng)向光適應(yīng)的轉(zhuǎn)變過程中)，光傳感網(wǎng)絡(luò)中的轉(zhuǎn)錄因子在下游轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中起著重要作用[5]。光感受器可接受光環(huán)境的轉(zhuǎn)變信號，并激活bZIP，bHLH，MYB，Zinc-finger，GATA等多種中介轉(zhuǎn)錄因子。這些中介轉(zhuǎn)錄因子與光響應(yīng)元件(LREs，Light responsive elements)結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[6]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子家族基因LONGHYPOCOTYL5(HY5)在光誘導(dǎo)基因表達(dá)中起中心調(diào)控因子的作用[7]。擬南芥hy5突變體在光下不能進(jìn)行從暗適應(yīng)到光適應(yīng)的過渡[8]。從暗適應(yīng)過渡到光適應(yīng)的一個普遍特征是某些器官(如下胚軸)的細(xì)胞擴張受到抑制，而另一些器官的細(xì)胞擴張增加，以及莖和根的分生組織進(jìn)行持續(xù)的細(xì)胞分裂而開始生長[5]。擬南芥hy5突變體失去了對下胚軸伸長的抑制，呈現(xiàn)出典型的暗適應(yīng)生長模式，這表明HY5基因在植物光響應(yīng)上起到關(guān)鍵作用[8]。HY5可以通過調(diào)控下游基因的表達(dá)來協(xié)調(diào)光信號及特定基因表達(dá)，以響應(yīng)光信號傳導(dǎo)，從而正向調(diào)控植物的光形態(tài)建成過程[8]。相較于野生型，hy5突變苗在遠(yuǎn)紅光和UV-B光下，下胚軸長度有所增加，同時，HY5也可促進(jìn)光敏色素、隱色素和UV-B光受體下游的光形態(tài)發(fā)生[9]。

此外，HY5也是植物生長發(fā)育的重要調(diào)控因子，它參與細(xì)胞伸長、細(xì)胞增殖、葉綠體發(fā)育、色素積累和營養(yǎng)物質(zhì)同化等多項發(fā)育過程[10]。近年來，HY5在激素、營養(yǎng)、萜烯合成、防御和溫度反應(yīng)等信號級聯(lián)中的作用也逐漸被揭示[6]。

日本結(jié)縷草(Zoysiajaponica)主要生長在中國、韓國、日本等東亞國家的溫暖和過渡氣候的地區(qū)，是觀賞草坪及運動場草坪中最廣泛使用的多年生暖季型草坪草之一。結(jié)縷草耐踐踏、彈性良好、再生力強、病蟲害少且只需較少的維護(hù)投入[11-12]。但是，北方地區(qū)的日本結(jié)縷草生長季節(jié)短，綠期短，這成為結(jié)縷草利用的主要限制因素[13]。本研究對日本結(jié)縷草ZjHY5基因生物信息、亞細(xì)胞定位及自激活檢測的研究，可為后續(xù)日本結(jié)縷草響應(yīng)光刺激的基礎(chǔ)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用日本結(jié)縷草購自Hancock公司，種植于北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所人工氣候箱內(nèi)，光周期為14/10 h(日/夜)，溫度為26℃，濕度為60%。大腸桿菌感受態(tài)DH5α，DNA Maker DL2000PlusⅡ購自北京全式金公司。無縫連接酶購自碧云天生物公司。GoldStar Best MasterMix從北京康為世紀(jì)生物公司購買。pMD18-T克隆載體，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶NcoI、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、酵母缺素培養(yǎng)基、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒、PrimeSTAR MAX Premix、金擔(dān)子素(Aureobasidin A)和X-α-Gal等均購自Takara公司。RNA提取試劑盒、純化試劑盒和質(zhì)粒DNA提取試劑盒均從OMEGA公司購買。酵母菌株Y2HGold、酵母誘餌表達(dá)載體pGBKT7為本課題組保存。其它常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純化。引物合成由睿博生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1引物設(shè)計 根據(jù)本實驗室測得的日本結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，應(yīng)用Primer Premier 5軟件設(shè)計ZjHY5-F和ZjHY5-R引物，用于擴增ZjHY5基因的全長序列。使用通用引物M13-F和M13-R來完成pMD-18T載體檢測。依據(jù)ZjHY5全長序列測序結(jié)果和載體pGBKT7序列設(shè)計pGBKT7-ZjHY5-F和pGBKT7-ZjHY5-R載體連接引物，用于構(gòu)建酵母表達(dá)載體，并應(yīng)用通用引物T7和3-BD來進(jìn)行檢測。Y3-ZjHY5-F(GGGGACTCTTGACCATGGTAGCTTTTCTTCCCCCTTGCGG)及Y3-ZJHY5-R(ACACGCGTACTAGTCAGATC-GCTCTTGGTGAAGTGGTGCT)用于亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建。應(yīng)用通用引物Y3-F(GGGGACTCTTGACCATGGTA)及Y3-R(ACACGCGTACTAGTCAGATC)進(jìn)行檢測。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

1.2.2ZjHY5基因克隆 選取生長12周新鮮健康的日本結(jié)縷草株系，將其葉片摘下并剪碎放入研缽中，加入液氮進(jìn)行研磨。按照RNA提取試劑盒說明書來提取RNA。對日本結(jié)縷草葉片總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用合成的cDNA作為模板，以ZjHY5-F和ZjHY5-R為引物，用2×GoldStar Taq MasterMix擴增ZjHY5基因片段。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃5 min；12℃保溫。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，將符合長度預(yù)期的片段進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物與pMD-18T載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，于37℃下進(jìn)行卡那霉素抗性篩選培養(yǎng)，挑取菌落，應(yīng)用通用引物M13-F及M13-R進(jìn)行PCR檢測，程序為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個循環(huán)；72℃5 min；12℃保溫。將檢測長度符合大腸桿菌菌落送至生物技術(shù)公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果進(jìn)行比對確保擴增正確的目的基因。

1.2.3生物信息學(xué)分析 ZjHY5蛋白保守結(jié)構(gòu)域通過NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)來進(jìn)行分析。通過SOPMA (https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home)對ZjHY5蛋白一級、二級、三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，利用ExPASy數(shù)據(jù)庫(http://expasy.org/)對ZjHY5蛋白各級結(jié)構(gòu)的特性進(jìn)行分析。Cell-PLoc 2.0網(wǎng)站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)用于預(yù)測ZjHY5蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。目的基因ZjHY5信號肽的預(yù)測用SignalP4.1Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)來完成。

1.2.4pGBKT7-ZjHY5誘餌表達(dá)載體構(gòu)建 將測序結(jié)果符合預(yù)期的大腸桿菌菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取并以其為模板，使用引物pGBKT7-ZjHY5-F和pGBKT7-ZjHY5-R進(jìn)行PCR擴增來用于誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建。利用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ將載體pGBKT7在37℃條件下酶切處理15 min，通過In-Fusion連接酶將純化后的擴增產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物在50℃下連接15 min。然后將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化后涂在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行卡那霉素篩選培養(yǎng)。挑菌后進(jìn)行菌落PCR檢測，經(jīng)過凝膠電泳檢測選取片段大小合適的大腸桿菌菌液送至生物公司測序驗證。

1.2.5Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化及自激活作用檢測 將符合測序結(jié)果的大腸桿菌菌液大量富集并提取質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pGBKT7-ZjHY5。應(yīng)用醋酸鋰法制備Y2HGold感受態(tài)酵母細(xì)胞，并將重組質(zhì)粒pGBKT7-ZjHY5轉(zhuǎn)入其中[12]。將轉(zhuǎn)化得到的酵母菌均勻地涂在SD/-Trp培養(yǎng)基上培養(yǎng)，2～3 d后將培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行PCR擴增以檢驗酵母重組質(zhì)粒pGBKT7-ZjHY5是否成功轉(zhuǎn)化至Y2HGold細(xì)胞。將上述成功轉(zhuǎn)化的菌液分別稀釋10倍、100倍、1 000倍后接種在缺失培養(yǎng)基SD/-Trp，SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA中，于30℃下倒置培養(yǎng)3～4 d后，觀察其生長狀態(tài)并記錄[12]。

1.2.6亞細(xì)胞定位 使用引物Y3-ZjHY5-F和Y3-ZjHY5-R進(jìn)行PCR擴增，并應(yīng)用EcoR Ⅰ對Y3載體進(jìn)行單酶切，用于亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建，并將其轉(zhuǎn)化到制備好的EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)中，準(zhǔn)備生長健康的本生煙草(Nicotianatabacum)葉片并完成注射，然后將其置于黑暗條件下培養(yǎng)2 d。通過使用共聚焦顯微鏡(Leica，SP-8)來觀察信號在細(xì)胞中的分布情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZjHY5的克隆及保守結(jié)構(gòu)域分析

應(yīng)用日本結(jié)縷草cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴增，ZjHY5基因開放閱讀框為711 bp，編碼236個氨基酸殘基(圖1，圖2)。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，ZjHY5蛋白屬于bZIP超家族(圖3)。ZjHY5內(nèi)存在bZIP-HY5-like保守結(jié)構(gòu)域。在調(diào)節(jié)一系列不同細(xì)胞的過程中，bZIP因子在同源及異源二聚體的網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用。bZIP結(jié)構(gòu)基序包含一個基本區(qū)域和一個亮氨酸拉鏈。α-螺旋和亮氨酸殘基分開的7個氨基酸，與一個平行的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域形成穩(wěn)定二聚體。

圖1 日本結(jié)縷草ZjHY5基因的克隆Fig.1 Cloning of ZjHY5 gene from Zoysia japonica

圖2 日本結(jié)縷草ZjHY5 基因的cDNA序列及蛋白質(zhì)序列Fig.2 cDNA sequence and protein sequence of ZjHY5 gene from Zoysia japonica

圖3 日本結(jié)縷草ZjHY5 的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 The conserved domain of ZjHY5 from Zoysia japonica

2.2 ZjHY5蛋白特性

ZjHY5蛋白由236個氨基酸構(gòu)成，分子式為C1076H1771N345O368S3，蛋白分子質(zhì)量為25.525 1 kD，理論等電點為8.89。其負(fù)電荷殘基數(shù)量為37，正電荷殘基數(shù)量為40；不穩(wěn)定指數(shù)為 55.00，經(jīng)預(yù)測，其蛋白性質(zhì)不穩(wěn)定。二級(圖4)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖5)結(jié)果顯示，ZjHY5蛋白主要由α螺旋及無規(guī)則卷曲構(gòu)成，其各占二級結(jié)構(gòu)總比例的47.46%和41.53%，其余結(jié)構(gòu)(包括延伸鏈及β轉(zhuǎn)角)僅占總比例的11.01%。信號肽預(yù)測(圖6)結(jié)果顯示，ZjHY5蛋白有信號肽的概率為1.327%。利用MEGA 5.0 軟件對ZjHY5與HY5同源蛋白進(jìn)行比對并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化樹顯示日本結(jié)縷草中的HY5蛋白與漆姑草(Saginajaponica)及苜蓿(Medicagosativa)中HY5蛋白氨基酸相似度最高(圖7)。

圖4 日本結(jié)縷草ZjHY5蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Secondary structure prediction of ZjHY5 protein from Zoysia japonica

圖5 日本結(jié)縷草ZjHY5蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Tertiary structure prediction of ZjHY5 protein from Zoysia japonica

圖6 日本結(jié)縷草ZjHY5信號肽預(yù)測Fig.6 Prediction of ZjHY5 signal peptide from Zoysia japonica

圖7 日本結(jié)縷草ZjHY5蛋白的遺傳進(jìn)化樹分析Fig.7 Phylogenetic analysis of ZjHY5 protein from Zoysia japonica注:DlHY5表示QRV61374.1 龍眼(Dimocarpus longan)HY5-like，MdHY5表示NP 001280752.1 蘋果(Malus domestica)HY5，BrHY5表示XP 009121971.1 蕪菁(Brassica rapa)HY5-like，GrHY5表示AIC64080.1 滇龍膽草(Gentiana rigescenss)HY5，SlHY5表示NP 001234820.1 番茄(Solanum lycopersicum)HY5，AtHY5表示BAA21327.1 擬南芥(Arabidopsis thaliana)HY5，VvHY5表示AGX85877.1 葡萄(Vitis vinifera)HY5，MtHY5表示XP_003622910.1 苜蓿(Medicago truncatula)HY5-like，CqHY5表示QEM23328.1 南漆姑草(Colobanthus quitensis)HY5-likeNote:DlHY5 stands for QRV61374.1 Dimocarpus longan HY5-like,MdHY5 stands for NP 001280752.1 Malus domestica HY5,BrHY5 stands for XP 009121971.1 Brassica rapa HY5-like,GrHY5 stands for AIC64080.1 Gentiana rigescenss HY5,SlHY5 stands for NP 001234820.1 Solanum lycopersicum HY5,AtHY5 stands for BAA21327.1 Arabidopsis thaliana HY5,VvHY5 stands for AGX85877.1 Vitis vinifera HY5,MtHY5 stands for XP_003622910.1 Medicago truncatula HY5-like,CqHY5 stands for QEM23328.1 Colobanthus quitensis HY5-like

2.3 亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示ZjHY5蛋白定位于細(xì)胞核中，為了進(jìn)一步驗證ZjHY5在細(xì)胞中的定位情況，進(jìn)行煙草的亞細(xì)胞定位試驗。將成功轉(zhuǎn)化35S-ZjHY5-YFP以及35S-YFP載體的農(nóng)桿菌進(jìn)行煙草注射，并在共聚焦顯微鏡下觀察熒光蛋白分布情況，預(yù)測結(jié)果顯示，ZjHY5蛋白定位于細(xì)胞核(圖8A,圖8B,圖8C)。

圖8 ZjHY5亞細(xì)胞定位Fig.8 Subcellular localization of ZjHY5注：A,D為激發(fā)光下35S-ZjHY5-YFP；B,E為融合場；C,F為葉綠體自發(fā)熒光Note:A,D stand for ultraviolet field 35S-ZjHY5-YFP fluorescence；B,E stand for merged；C,F stand for chloroplast autofluorescence

2.4 酵母自激活檢測

將成功轉(zhuǎn)化pGBKT7-ZjHY5誘餌表達(dá)載體的酵母菌株經(jīng)過稀釋后，涂布于3種缺陷固體培養(yǎng)基SD/-Trp，SD/-Trp/X-a-Gal，SD/-Trp/X-a-Gal/AbA上培養(yǎng)2～3 d，并對其生長情況進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，SD/-Trp單缺培養(yǎng)基有酵母菌落正常生長，SD/-Trp/X-a-Gal培養(yǎng)基上有酵母菌落正常生長但沒有顯示藍(lán)色，轉(zhuǎn)入pGBKT7-ZjHY5的酵母菌株在SD/-Trp/X-a-Gal/AbA培養(yǎng)基上未見生長且無顏色變化(圖9)。因此構(gòu)建成功的pGBKT7-ZjHY5誘餌表達(dá)載體不能激活酵母菌株營養(yǎng)缺陷型報告基因的表達(dá)，可用于后續(xù)酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行的蛋白篩選。

圖9 pGBKT7-ZjHY5酵母轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄自激活檢測Fig.9 Autonomous transcriptional activation of PGBKT7-ZjHY5

3 討論

ZjHY5基因?qū)儆赽ZIP超家族中的一員。bZIP超家族是最大、最保守的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其廣泛分布于各個真核生物基因組中并參與光形態(tài)建成和光信號傳導(dǎo)，種子成熟及種子萌發(fā)等生物學(xué)過程[14]。ZjHY5蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要形式為α螺旋和無規(guī)則卷曲，兩者共約占二級結(jié)構(gòu)總比例的90%。信號肽預(yù)測發(fā)現(xiàn)，ZjHY5蛋白有信號肽的概率為1.327%，預(yù)測結(jié)果顯示ZjHY5蛋白無信號肽。進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果顯示，ZjHY5蛋白與漆姑草(Saginajaponica)及苜蓿(Medicagosativa)中HY5蛋白的親緣關(guān)系最近。HY5轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被證實是光形態(tài)建成的正向調(diào)控因子，參與植物光、激素及應(yīng)激信號的應(yīng)激反應(yīng)[15-16]。有研究者認(rèn)為，光受體靶向轉(zhuǎn)錄因子HY5可能是一種潛在的莖到根信號轉(zhuǎn)換器，HY5在子葉中經(jīng)過光合作用介導(dǎo)的誘導(dǎo)，可以從莖運輸?shù)礁?，可能通過韌皮部，然后在根中激活硝酸鹽轉(zhuǎn)運體[17]。HY5具有向根系傳播光環(huán)境信息的潛在功能[18]。HY5作為下胚軸伸長、花青素和葉綠素積累的調(diào)節(jié)因子，受到組成型光形態(tài)建成1(Constitutively photomorphogenic 1，COP1)介導(dǎo)，整合大量的內(nèi)外信號通路，在光誘導(dǎo)的光形態(tài)建成中發(fā)揮最突出的作用[19]。HY5受COP1泛素連接酶調(diào)控[19]。在黑暗條件下，PhyB部分失活，光形態(tài)形成因子的活性受到抑制，光敏色素互作因子(Phytochrome-interacting factors，PIFs)的穩(wěn)定性提高，COP1與轉(zhuǎn)錄因子HY5相互作用，通過破壞它們與各自的光響應(yīng)啟動子元件(以LRE1為例)的接觸，改變它們的活性構(gòu)象從而使它們喪失轉(zhuǎn)錄活性(圖10A)。細(xì)胞核內(nèi)，COP1酶以HY5為靶點，在黑暗環(huán)境中介導(dǎo)HY5蛋白降解，從而抑制光形態(tài)建成(圖10B)，HY5蛋白在細(xì)胞核內(nèi)行使調(diào)控功能，這同亞細(xì)胞定位結(jié)果相似。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示ZjHY5蛋白定位于細(xì)胞核中。在光照情況下，紅光通過光受體PhyB抑制COP1來增強bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族MYC蛋白的穩(wěn)定性[20]。MYC轉(zhuǎn)錄因子是光形態(tài)形成的調(diào)控因子和PhyB的靶標(biāo)，可以增強HY5的活性，從而促進(jìn)光形態(tài)發(fā)生[21]。試驗結(jié)果表明ZjHY5無自激活活性，可用于后期蛋白互作試驗以探究日本結(jié)縷草ZjHY5基因在光誘導(dǎo)基因表達(dá)中的調(diào)控作用。

圖10 COP1-HY5調(diào)控模式模型[19，21]Fig. 10 COP1-HY5 module regulatory model

4 結(jié)論

本試驗成功克隆日本結(jié)縷草ZjHY5基因。ZjHY5基因開放閱讀框為711 bp，編碼236個氨基酸殘基。預(yù)測結(jié)果顯示該基因ZjHY5蛋白無信號肽，進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果顯示，ZjHY5蛋白與漆姑草及苜蓿中HY5蛋白的親緣關(guān)系最近。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，ZjHY5定位于細(xì)胞核中。本試驗成功構(gòu)建了pGBKT7-ZjHY5酵母誘餌載體，通過對比不同培養(yǎng)基上的酵母單菌落生長情況，發(fā)現(xiàn)ZjHY5基因無自激活活性，可用于后續(xù)酵母雙雜交試驗篩選與ZjHY5編碼蛋白相互作用的相關(guān)蛋白，為研究ZjHY5基因的作用機制奠定基礎(chǔ)。