基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序挖掘小麥葉片抗旱相關(guān)基因

曾倩倩，劉 巖，朱 墨，邱宗波

（河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/河南省農(nóng)業(yè)微生物生態(tài)與技術(shù)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453007）

【研究意義】小麥（Triticum aestivumL.）在世界范圍內(nèi)廣泛種植，除水稻外，其種植面積和產(chǎn)量最高，屬于我國(guó)主要的商品糧和儲(chǔ)藏糧，對(duì)推動(dòng)國(guó)家糧食安全、生態(tài)環(huán)境保護(hù)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展有重要作用［1］。伴隨全球氣候變化和水資源缺乏問題突出，干旱已成為目前制約小麥生長(zhǎng)和發(fā)育的主要非生物脅迫因素之一。干旱脅迫可使植物葉片干枯萎縮、降低相對(duì)含水量、增加活性氧自由基和丙二醛含量等，進(jìn)而發(fā)生膜脂過氧化，導(dǎo)致植物氧化損傷甚至死亡，嚴(yán)重阻礙了小麥的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)及品質(zhì)［2-3］。因此，研究小麥響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)理對(duì)提高小麥耐旱能力具有重要的理論和實(shí)踐意義。

【前人研究進(jìn)展】干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致植物生理指標(biāo)產(chǎn)生改變，其基因表達(dá)類型及表達(dá)水平也會(huì)在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生變化。近年來，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）已成為研究植物在某一特定環(huán)境和時(shí)間下基因表達(dá)情況的重要手段，利用該技術(shù)可以獲得大量逆境脅迫下植物細(xì)胞的基因表達(dá)模式信息，能夠深入研究植物在分子水平對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)［4］。利用RNA-Seq 技術(shù)，已在玉米、向日葵和水稻等植物中鑒定了多種響應(yīng)逆境脅迫（如低溫、干旱和病菌等）的相關(guān)基因。李武等［5］利用RNA-Seq 技術(shù)，對(duì)耐低溫發(fā)芽差異的母本及其自交系后代進(jìn)行分析，從不同玉米材料中獲得410 個(gè)差異表達(dá)基因（Differentially Expressed Genes,DEGs），從中進(jìn)一步篩選出20 個(gè)可能與低溫萌發(fā)密切相關(guān)的基因，為后續(xù)玉米種質(zhì)資源的研究奠定基礎(chǔ)。田雪慧等［6］利用RNA-Seq 技術(shù)在低溫處理百合中發(fā)現(xiàn)了大量響應(yīng)冷害的相關(guān)基因，為揭示蘭州百合抗凍分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。Liang 等［7］使用聚乙二醇6000 對(duì)苗期向日葵進(jìn)行模擬干旱脅迫處理，之后對(duì)根系及葉片進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)9 個(gè)可能的抗旱相關(guān)基因，為研究向日葵干旱響應(yīng)機(jī)制提供了新資源。

【本研究切入點(diǎn)】RNA-Seq 技術(shù)的迅猛發(fā)展和生物信息學(xué)分析方法的快速改進(jìn)，使得更快速高效地從各種生物中獲取大量基因信息成為可能。此外，小麥基因組圖譜注釋信息的不斷完善，為運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組分析方法探索小麥抗旱分子機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用高通量RNA-Seq 技術(shù)，對(duì)自然干旱處理的小麥幼苗葉片進(jìn)行測(cè)序分析，挖掘小麥干旱脅迫應(yīng)答的關(guān)鍵基因，解析小麥干旱脅迫的分子機(jī)制，豐富植物抗旱基因組數(shù)據(jù)，為后續(xù)研究提供更多的遺傳資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥品種為黃淮麥區(qū)大面積推廣的鄭麥366號(hào)，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。試驗(yàn)在河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的光照培養(yǎng)室進(jìn)行。2021年9 月，選取形態(tài)飽滿、大小均勻的小麥種子，用0.1%HgCl2消毒2 min 后用去離子水沖洗干凈，播種在鋪有2 層濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽。待出芽后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的小麥幼苗分別移栽至營(yíng)養(yǎng)土和蛭石混合的塑料花盆中（40 棵/盆，10 盆），培養(yǎng)于人工氣候室中，生長(zhǎng)溫度25 ℃/18 ℃（晝/夜），相對(duì)濕度75%，光照周期12 h/12 h，光照強(qiáng)度400 μmol/m2·s，澆以自來水。待幼苗長(zhǎng)至二葉一心時(shí)，5 盆幼苗繼續(xù)澆以自來水（對(duì)照），另5 盆幼苗停止?jié)菜ㄗ匀桓珊堤幚恚Ｔ谕Ｖ節(jié)菜? d（土壤相對(duì)含水量為50%），分別取對(duì)照和自然干旱處理小麥幼苗的葉片，用液氮速凍后于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 丙二醛和相對(duì)含水量的測(cè)定 參照Niu等［8］的方法測(cè)定小麥幼苗葉片的丙二醛（MDA）含量，參照Wasaya 等［9］的方法檢測(cè)葉片相對(duì)含水量。

1.2.2 RNA 提取、cDNA 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 對(duì)照和干旱處理小麥幼苗葉片總RNA 由北京諾禾致源生物公司采用TRIzol 法提取并完成質(zhì)量分析和cDNA 文庫(kù)構(gòu)建，利用Illumina HiSeq 2500 平臺(tái)進(jìn)行RNA-Seq 測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)組裝及DEGs篩選 過濾原始序列（raw reads）得到高質(zhì)量的干凈序列（clean reads）。利用Trinity 軟件組裝clean reads，之后使用TGICL軟件聚類去冗余得到單基因簇（Unigene）。利用FPKM 值代表基因表達(dá)量水平。根據(jù)|log2(Fold change)|>1 且FDR＜0.05 篩選DEGs，并進(jìn)行DEGs的GO 功能分類(http://www.geneontology.org/)與KEGG 代謝通路富集(http://www.kegg.jp/kegg/kaas/)分析。

1.2.4 熒光定量PCR 驗(yàn)證 為驗(yàn)證RNA-Seq 測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，挑選5 個(gè)與干旱脅迫相關(guān)的DEGs，運(yùn)用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。采用植物總RNA 提取試劑盒（RNAprep Pure Plant Kit，天根生化科技有限公司）獲得小麥葉片總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara 公司）合成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-tirne PCR,qRT-PCR）采用Rotor-Gene 3000 Real-Time PCR System（美國(guó)）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每次試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)體系參照SYBR?Premix Ex Taq? II 試劑盒（Takara 公司）說明書進(jìn)行。以小麥Tubulin（GenBank 登錄號(hào)：HQ171897）為內(nèi)參基因，擴(kuò)增結(jié)果用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。

表1 qRT-PCR 引物Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱處理對(duì)小麥幼苗葉片丙二醛含量和相對(duì)含水量的影響

從圖1 可以看出，干旱處理后的小麥葉片MDA 含量顯著增加，比對(duì)照增加20.36%，相對(duì)含水量顯著降低，比對(duì)照下降11.41%，說明此時(shí)小麥的細(xì)胞膜已受到嚴(yán)重?fù)p傷。

圖1 干旱處理對(duì)小麥幼苗丙二醛含量和相對(duì)含水量的影響Fig.1 Effects of drought stress on MDA content and relative water content in wheat seedlings

2.2 小麥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與數(shù)據(jù)組裝

為進(jìn)一步探索小麥幼苗在轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答，采用Illumina HiSeq 2500 平臺(tái)將對(duì)照和干旱處理的小麥葉片進(jìn)行RNA-Seq。數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量控制后，對(duì)照獲得45 471 018 個(gè)clean reads 片段，包含6.82 Gb 堿基信息。干旱處理獲得45 133 470 個(gè)clean reads 片段，包含6.39 Gb堿基信息，GC 含量分別為49.58% 和50.82%，Q30（測(cè)序錯(cuò)誤率小于 0.1%）均在90%以上（表2）。說明Illumina 平臺(tái)所得到的小麥轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)量和質(zhì)量均較高，為后續(xù)組裝和分析提供了較好的數(shù)據(jù)。

表2 小麥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of sequencing analysis of wheat transcriptome

利用Trinity 軟件對(duì)測(cè)序所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接組裝，分別得到188 334 個(gè)轉(zhuǎn)錄本和119 588 個(gè)Unigene。轉(zhuǎn)錄本序列總長(zhǎng)度為150 788 752 bp，平均長(zhǎng)度為801 bp，N50 為1 320 bp。Unigene 總長(zhǎng)度為131 025 642 bp，平均長(zhǎng)度為1 096 bp，N50 為1 520 bp，最長(zhǎng)的Unigene 為17 700 bp，最短的為201 bp（表3）。Unigene的N50 長(zhǎng)度比其平均長(zhǎng)度增加約40%，而轉(zhuǎn)錄本的N50 長(zhǎng)度比其平均長(zhǎng)度增加65%，說明數(shù)據(jù)組裝質(zhì)量較好。

表3 轉(zhuǎn)錄本和單基因簇統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of assembled transcripts and unigenes

2.3 干旱處理對(duì)小麥葉片差異表達(dá)基因的影響

以FDR＜ 0.05 且|log2Fold change|>1 作為篩選條件，對(duì)獲得的對(duì)照和干旱脅迫處理小麥葉片的DEGs 分析結(jié)果用火山圖展示。結(jié)果（圖2）表明，對(duì)照與干旱脅迫處理相比，共獲得1 207個(gè)DEGs，其中752 個(gè)上調(diào)、455 個(gè)下調(diào)，上調(diào)基因在數(shù)量上高于下調(diào)基因。

圖2 對(duì)照與干旱處理小麥葉片DEGs的火山圖Fig.2 Volcano plots of DEGs in wheat leaves between control and drought treatment groups

2.4 小麥葉片差異表達(dá)基因的GO 與KEGG 富集分析

本研究中1 207 個(gè)DEGs 獲得GO 功能分類，DEGs 上、下調(diào)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖3。由圖3 可知，上調(diào)的DEGs 中，主要?dú)w類為代謝過程和甘油代謝過程（生物過程類別）、膜和細(xì)胞部分（細(xì)胞組分）、水解酶活性和催化活性（分子功能）；下調(diào)的DEGs 中，主要?dú)w類為代謝過程和主要代謝過程（生物過程）、細(xì)胞器和細(xì)胞（細(xì)胞組分）、催化活性和氧化還原酶活性（分子功能）。整體上來看，GO 富集分析在絕大部分同一條目下富集的DEGs 中上調(diào)基因數(shù)量多于下調(diào)基因數(shù)量，但在細(xì)胞器和細(xì)胞條目中下調(diào)基因數(shù)量高于上調(diào)基因數(shù)量。

圖3 小麥葉片DEGs的GO 功能分類Fig.3 GO classification of DEGs in wheat leaves

經(jīng)KEGG 富集顯示，兩組樣品的1 207 個(gè)DEGs 共富集得到65 條信號(hào)通路，其中有9 條信號(hào)通路富集顯著（P＜ 0.05），主要包括淀粉和蔗糖代謝（富集的DEGs 數(shù)最多）、卟啉和葉綠素代謝、光合作用-天線蛋白、光合作用、苯丙烷生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、甘油磷脂代謝、氨基酸代謝、光合生物中的碳固定等（圖4）。

圖4 小麥葉片DEGs的KEGG 富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of DEGs in wheat leaves

2.5 小麥葉片差異表達(dá)基因的熒光定量驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-seq 結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇5 個(gè)抗氧化酶基因進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)。由圖5 可見，5 個(gè)基因的表達(dá)變化情況與RNA-Seq 一致，表明測(cè)序結(jié)果較為準(zhǔn)確、可靠。此外，5 個(gè)抗氧化酶基因均上調(diào)表達(dá)，且POD和CAT基因的表達(dá)變化水平高于SOD、GST和GSH-Px，說明干旱脅迫可以誘導(dǎo)抗氧化酶基因及相關(guān)物質(zhì)的表達(dá)，且POD和CAT基因可能起主導(dǎo)作用，促進(jìn)小麥對(duì)活性氧的清除，降低活性氧對(duì)細(xì)胞的膜系統(tǒng)傷害。

圖5 干旱處理小麥葉片DEGs的qRT-PCR 表達(dá)分析Fig.5 qRT-PCR analysis of DEGs in wheat leaves under drought stress

3 討論

干旱對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝、生殖發(fā)育等多種生物過程均會(huì)造成不利影響，是限制糧食作物品質(zhì)和產(chǎn)量的主要逆境災(zāi)害之一［10-11］。研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫后，植物可在生理生化和分子水平方面作出脅迫響應(yīng)以抵御逆境損傷，降低環(huán)境傷害［12-13］。植物受到干旱刺激后，能夠誘導(dǎo)體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)控逆境脅迫應(yīng)答，相對(duì)含水量在滲透調(diào)節(jié)過程中具有重要作用，可以反映植物對(duì)干旱的耐受性［14］。Meher 等［14］用不同濃度的PEG6000 處理花生24 h，結(jié)果表明，隨著PEG6000 濃度的增加，葉片和根中相對(duì)含水量均顯著降低。此外，胡艷等［15］研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤干旱脅迫的逐漸加劇，黑果腺肋花楸葉片相對(duì)

含水量逐漸降低。本研究結(jié)果與該結(jié)果一致，間接反映了植物的氣孔狀況和光合功能受到影響。植物在逆境脅迫下會(huì)誘導(dǎo)生成活性氧，這些活性氧與生物大分子（脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等）發(fā)生反應(yīng)，最終生成MDA，造成膜傷害，進(jìn)而影響植物代謝過程［14］。本研究中，小麥在干旱脅迫下葉片的MDA 含量顯著高于對(duì)照，說明小麥細(xì)胞膜損傷嚴(yán)重。

當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，基因的表達(dá)模式和表達(dá)水平會(huì)發(fā)生顯著變化，通過挖掘和篩選調(diào)控干旱的基因，可以為研究植物適應(yīng)逆境提供新的思路和方法。RNA-Seq 是近年發(fā)展起來的用來鑒定差異表達(dá)基因的技術(shù)，是篩選抗逆基因的重要研究手段［16-17］。本研究采用Illumina Hiseq? 2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)干旱處理和對(duì)照的小麥葉片進(jìn)行了RNA-Seq，獲得的平均樣本數(shù)據(jù)量為6.82 Gb，通過Trinity 拼接組裝得到18 334 個(gè)轉(zhuǎn)錄本和119 588 個(gè)Unigene，共篩選獲得1 207 個(gè)DEGs，其中752 個(gè)上調(diào)，455 個(gè)下調(diào)，上調(diào)基因在數(shù)量上高于下調(diào)基因，可見，差異基因主要以上調(diào)表達(dá)為主。

植物響應(yīng)干旱脅迫是一個(gè)受多個(gè)基因控制，涉及多種途徑和多種代謝產(chǎn)物合成的復(fù)雜過程［18］。本研究中，GO 富集發(fā)現(xiàn)，小麥中檢測(cè)到的1 207 個(gè)DEGs 富集到3 個(gè)GO 本體的34 個(gè)條目下，整體來看，主要富集在水解酶活性、催化活性、代謝過程、甘油代謝過程、膜和細(xì)胞部分等，GO 分析在絕大部分同一條目下富集的DEGs 中上調(diào)基因數(shù)多于下調(diào)基因，說明小麥主要通過上調(diào)基因表達(dá)來響應(yīng)干旱脅迫，同時(shí)也說明干旱環(huán)境對(duì)小麥的脅迫作用是多方面、復(fù)雜的。KEGG 通路富集發(fā)現(xiàn)，DEGs 顯著富集在淀粉和蔗糖代謝、卟啉和葉綠素代謝、光合作用-天線蛋白、光合作用、苯丙烷生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、甘油磷脂代謝、氨基酸代謝、光合生物中的碳固定等通路。在干旱條件下，植物光合作用-天線蛋白、葉綠體組分、氨基酸代謝和碳代謝等通路受到影響，使得光合作用和物質(zhì)積累受到抑制，這可能是小麥葉片相對(duì)含水量降低及MDA 含量增加的主要原因。

研究表明，植物在逆境脅迫下體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生對(duì)自身有害的活性氧，一些抗氧化酶（如SOD 和CAT 等）及抗氧化劑具有清除活性氧的功能，能夠使其產(chǎn)生與清除達(dá)到平衡狀態(tài)，使之抵抗逆境脅迫，維持植物的正常生長(zhǎng)［19-20］。RNA-Seq 結(jié)果顯示，干旱條件下，富集在POD 和CAT 活性等功能組的多個(gè)DEGs 表達(dá)上調(diào)，可以促進(jìn)抗氧化酶及相關(guān)物質(zhì)的產(chǎn)生，提高小麥對(duì)活性氧的清除能力，從而降低活性氧對(duì)細(xì)胞的膜系統(tǒng)傷害。作為一種非酶促活性氧清除劑，谷胱甘肽類似于抗氧化酶，可以清除干旱脅迫誘導(dǎo)的自由基和過氧化物［21］。本研究中，編碼GST和GSH-Px的DEGs 在干旱脅迫下表達(dá)均上調(diào)，進(jìn)而調(diào)控谷胱甘肽的代謝過程，對(duì)于清除細(xì)胞代謝過程中累積的自由基，減輕細(xì)胞所受的干旱脅迫損傷具有重要作用。

4 結(jié)論

本研究對(duì)正常生長(zhǎng)與自然干旱處理下鄭麥366號(hào)的葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，共獲得1 207 個(gè)差異表達(dá)基因，其中752 個(gè)表達(dá)上調(diào)，455 個(gè)表達(dá)下調(diào)。GO 功能富集分析顯示，DEGs 主要富集在水解酶活性、催化活性、代謝過程、甘油代謝過程、膜和細(xì)胞部分、細(xì)胞和氧化還原酶活性等。KEGG 途徑富集分析發(fā)現(xiàn)，DEGs 顯著富集于淀粉和蔗糖代謝、卟啉和葉綠素代謝、光合作用-天線蛋白、光合作用、苯丙烷生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、甘油磷脂代謝、氨基酸代謝和光合生物中的碳固定等代謝通路。qRT-PCR 分析結(jié)果表明，5 個(gè)抗氧化酶基因的表達(dá)趨勢(shì)和RNA-Seq測(cè)序結(jié)果一致。此外，還候選了POD、POD、CAT及GST基因作為小麥自然干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的應(yīng)答候選基因。