不同氮源對竹屑發(fā)酵及大球蓋菇菌絲生長的影響研究

吳一凡，鐘楚夢，柳麗娜，陳 勝，魯勇波，謝錦忠*

(1.中國林業(yè)科學研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400； 2.安吉縣林業(yè)技術推廣中心，浙江 安吉 313300； 3.余姚市紫云閣生態(tài)農莊，浙江 余姚 315400)

竹子具有重要的生態(tài)經濟價值，是森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，廣泛分布在亞太、美洲和非洲地區(qū)，全球面積超過3 000萬hm2。近年來全球森林面積逐漸減少，但竹林面積卻不降反升[1]，竹材被公認為是1種巨大的可再生綠色資源。其富含纖維素且生長迅速，可作為替代木材、稻草等栽培食用菌的新型碳源。傳統(tǒng)的蘑菇堆肥主要為農作物秸稈與各種氮源混合堆制[2]，竹材含較多微生物難分解的硅和蠟質，在自然條件下難以被降解，需要經粉碎后堆制發(fā)酵才容易被微生物利用。已有研究表明，竹屑發(fā)酵后可被用于栽培竹蓀(Dictyophoraindusiata)、平菇(Pleurotusostreatus)、秀珍菇(P.geesteranus)等食用菌[3-4]，發(fā)酵栽培食用菌是最有效、最經濟利用木質纖維材料的生物手段之一。大球蓋菇(Strophariarugosoannulata)富含蛋白質、多糖，有較高的營養(yǎng)價值，并具有較強的生物學效率與抗逆性，是聯合國向發(fā)展中國家推薦栽培的10個食用菌之一[5]，其適宜栽培地區(qū)與全球竹資源的分布高度匹配，因此利用竹屑栽培大球蓋菇具有良好的應用前景。

氮素是真菌合成蛋白質、核酸和幾丁質(殼多糖)的主要成分，竹屑含氮量偏低，需補充合適的氮源才能適宜食用菌栽培，吳一凡等[6]研究表明竹屑添加8%的麥麩調節(jié)竹屑初始C/N為100后發(fā)酵栽培大球蓋菇生物學效率和品質最高，過高的有機氮添加會抑制竹屑發(fā)酵與大球蓋菇生長。孫萌[7]通過對大球蓋菇胞外酶活性的測定，研究得出黃豆粉為最佳氮源；武旭等[8]研究表明母種培養(yǎng)基添加15%～20%麥麩利于大球蓋菇菌絲密度、均勻度、長勢、平均生長速度的提高。施用不同的氮源對栽培料的堆制發(fā)酵具有顯著影響[9-10]，并能直接影響食用菌的生長發(fā)育，選擇合適的氮源能夠直接提高堆體的腐熟程度以及食用菌的生物學效率和品質[11]，但關于不同氮源對竹屑發(fā)酵以及大球蓋菇栽培的研究較少，缺乏對其最佳氮源的篩選與驗證。該研究以尿素、麥麩、玉米粉和菜籽餅這4種常見的有機氮源作為添加，旨在探討不同氮源添加下竹屑好氧堆肥后的理化性質及其接種大球蓋菇的菌絲生長情況，并分析其之間的相關性，為竹屑的基質化利用和大球蓋菇的推廣種植提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

2021年3月15日在杭州市富陽區(qū)中國林科院亞熱帶林業(yè)研究所虎山林區(qū)內進行不同氮源添加的竹屑堆肥試驗。竹屑來自于杭州市富陽區(qū)永昌鎮(zhèn)，為毛竹(Phyllostachysedulis)粗加工下腳料。試驗設5個處理(表1)，以不添加氮源的純竹屑作為對照(CK)，以尿素、 麥麩、 玉米粉和菜籽餅4種常見食用菌有機氮源作T1、T2、T3和T4處理，每個處理3個重復。將不同基質配比的竹屑翻拌均勻，添加水分使其含水量均在65%，置于內徑67.5 cm×48.0 cm×41.0 cm的泡沫箱內進行好氧堆肥。在第10 d和第20 d分別進行翻堆補水至含水量65%，使其再次發(fā)酵。第40 d各個處理溫度趨于環(huán)境溫度，且翻堆補水后溫度不再上升時結束發(fā)酵。在發(fā)酵結束后進行取樣，一部分樣品風干后粉碎，用于理化性質的測定；另一部分鮮樣用于測定大球蓋菇菌絲生長速度與生長勢。

表1 不同氮源添加處理Tab.1 Different nitrogen sources addition treatment

1.2 測定方法與數據分析

試驗數據采用Excel 365進行統(tǒng)計，采用SPSS 22進行數據差異性分析，采用Origin 2019進行繪圖。數據采用平均值±標準差進行表示，顯著性水平為P<0.05。

1.2.1理化指標的測定 試驗期間，于每天16:00用溫度計測定堆體表層下方25 cm深處的竹屑發(fā)酵溫度。將V(樣品)∶V(蒸餾水)=1∶5的體積混合，再經振蕩后靜止30 min，用EC計測定電導率，用pH計測定pH值。竹屑容重、總孔隙度、通氣孔隙度、持水孔隙度均采用環(huán)刀法測定[12]。全氮采用定氮儀(YLSZJ-SB-007)測定，總有機碳采用重鉻酸鉀容量法測定。可溶性糖采用蒽酮比色法測定，全磷和全鉀采用等離子發(fā)射光譜法測定，水解性氮采用堿擴散法測定。

1.2.2菌絲生長速度和長勢的測定 取各處理的等量250 g發(fā)酵竹屑置于內徑12 cm高10 cm帶透氣孔的玻璃瓶中，每個接種2 g大球蓋菇原種后置于24 ℃恒溫培養(yǎng)30 d，每天觀察記錄菌絲生長速度及長勢，每個處理設5次重復。

2 結果與分析

2.1 竹屑發(fā)酵過程中的溫度變化

有機物料在放線菌等微生物的活動下會產生高溫，堆體的溫度可以評價堆肥的效果，高溫能殺死堆體中的病原微生物促進物料分解。由圖1可知，對照組CK和添加尿素的處理無法達到有效發(fā)酵高溫(>50 ℃)。玉米粉處理在第3 d達到最高溫(55.4 ℃)，但高溫期持續(xù)時間較短(3 d)，在第5 d溫度出現明顯下降，且第一次翻堆后無法再次達到有效腐熟高溫(>50 ℃)。麥麩處理在第4 d達到了最高溫度(54.8 ℃)，高溫期共持續(xù)了8 d。菜籽餅在第3 d達到了最高溫度(58.5 ℃)，總高溫期持續(xù)最長(14 d)。第一次翻堆后僅麥麩和菜籽餅處理能夠再次達到50 ℃以上，第二次翻堆后麥麩和菜籽餅處理的溫度最高分別達到39.3 ℃和48.3 ℃，未能達到50 ℃以上的發(fā)酵高溫，40 d時各處理的溫度趨于穩(wěn)定，物料基本分解完畢，發(fā)酵進程基本結束。綜上，純竹屑自身缺乏氮源無法達到有效腐熟高溫，添加麥麩和菜籽餅的處理能達到有效腐熟高溫并持續(xù)8 d以上。

圖1 各處理基質發(fā)酵過程中的溫度變化Fig.1 Temperature change during fermentation of each treatment

2.2 不同氮源對竹屑發(fā)酵后物理性質的影響

分析不同處理竹屑堆制后的物理性質，由表2可知，各處理之間的容重、通氣孔隙度無顯著差異(P>0.05)，均在0.152～0.167 g·cm-3和49.70%～56.60%之間。對照組CK的持水孔隙度顯著(P<0.05)低于添加麥麩和菜籽餅的處理，但與添加尿素、玉米粉的處理之間無顯著差異。添加菜籽餅的處理持水孔隙度最高達到了27.97%，顯著高于其他處理。CK的總孔隙度顯著低于添加麥麩、玉米粉和菜籽餅的處理，但與添加尿素的處理無顯著差異。添加麥麩、玉米粉和菜籽餅3個處理之間的總孔隙度無顯著差異，均在76.13%～78.20%之間。添加菜籽餅處理的氣水比最低，顯著低于對照組CK，為1.8。綜上，添加氮源顯著提高了竹屑發(fā)酵后的持水孔隙度，降低氣水比，增加竹屑的持水性，對容重和通氣孔隙度無顯著影響，不同氮源的影響效果不同。

表2 竹屑添加不同氮源發(fā)酵后的物理性質Tab.2 Physical properties of bamboo sawdust with different nitrogen sources

2.3 不同氮源處理對竹屑發(fā)酵后pH和EC的影響

pH反映了物料的酸堿性，是影響微生物活動的重要因素之一，過高或過低都會抑制微生物活動和有機物的分解。由表3可知， 各處理pH均在6.21～6.62之間呈弱酸性。添加玉米粉處理的pH顯著高于CK，菜籽餅和麥麩處理的pH顯著低于CK，尿素處理的pH與CK無顯著差異。EC表示了堆體中可溶性鹽的含量，包括無機鹽及有機酸鹽等。過高的EC會對作物產生毒害。由表3可知，各處理EC均在212.00～394.00 us·cm-1之間，尿素處理的EC與CK無顯著差異，均顯著低于其他3個處理。麥麩處理的EC最高，菜籽餅次之，分別達到了394.00和301.00 us·cm-1。綜上，添加氮源能顯著降低堆體的pH，提高EC，不同氮源改變的程度存在差異。

表3 竹屑添加不同氮源發(fā)酵后的pH和ECTab.3 pH and EC after bamboo sawdust fermentation with different nitrogen sources

2.4 不同氮源處理對竹屑發(fā)酵后養(yǎng)分的影響

由表4可知，添加尿素處理的全氮和水解性氮顯著高于CK，碳氮比和全鉀顯著低于CK，其他養(yǎng)分含量與CK無顯著差異。添加麥麩、玉米粉和菜籽餅發(fā)酵后，能顯著提高培養(yǎng)料的全氮、全磷、全鉀和可溶性糖含量，降低碳氮比。其中添加菜籽餅處理的有機碳含量和碳氮比最低，分別為43.25%和44.02，顯著低于其他處理；全氮、水解性氮和可溶性糖含量最高，分別為0.99%、733.00 mg·kg-1和0.82%，顯著高于其他處理。添加麥麩處理的全磷含量達到了12.35%，顯著高于其他處理，添加麥麩和菜籽餅的處理在全鉀含量上無顯著差異，均為0.25%，顯著高于其他處理。

表4 竹屑添加不同氮源發(fā)酵后的養(yǎng)分含量Tab.4 Nutrient content after bamboo sawdust fermentation with different nitrogen sources

綜上，添加氮源能夠顯著提高竹屑的全氮、全磷、全鉀、水解性氮和可溶性糖含量，降低有機碳含量和碳氮比，添加不同有機氮源所提高的養(yǎng)分含量不同。

2.5 不同氮源處理對竹屑發(fā)酵后大球蓋菇菌絲生長的影響

利用各處理的培養(yǎng)料接種大球蓋菇，由表5可知，無氮源添加的純竹屑CK處理的菌絲纖細柔弱，生長速度最慢，僅為1.84 mm·d-1。添加氮源處理的各處理菌絲生長速度和長勢均顯著高于CK。添加尿素、麥麩和玉米粉3個處理的菌絲生長速度無顯著差異，均在2.67～2.73 mm·d-1之間。添加菜籽餅處理的菌絲生長速度最快，達到了3.24 mm·d-1，顯著高于其他氮源添加處理，且長勢最佳，菌絲潔白粗壯且濃密。可見，竹屑添加氮源發(fā)酵后能顯著提高大球蓋菇菌絲的生長速度和菌絲長勢，可縮短大球蓋菇栽培種的培養(yǎng)時間，一般500 g規(guī)格栽培種只需要培養(yǎng)35 d即可用于生產。

表5 不同處理大球蓋菇菌絲的生長情況Tab.5 Mycelial growth of S. rugosoannulata under different treatments

2.6 菌絲生長指標與堆體理化性質的相關性分析

對菌絲生長指標與堆體的物理性質、養(yǎng)分要素分別進行相關性分析。由圖2可知，在物理性質要素中，菌絲生長速度與持水孔隙度、總孔隙度和氣水比呈極顯著相關，菌絲長勢與持水孔隙度和氣水比呈極顯著相關，與pH呈顯著相關。在養(yǎng)分要素中，菌絲生長速度和長勢均與全氮、水解性氮、可溶性糖、C/N呈極顯著相關，與其他指標弱相關。

圖2 菌絲生長指標與堆體理化性質的相關性熱圖Fig.2 Heat map of correlation between mycelial growth index and properties of bamboo sawdust說明：**代表相關性極顯著(P<0.01)，*代表相關性顯著(P<0.05)。Note: **indicated extremely significant difference (P<0.01), *indicated significant difference (P<0.05).

3 討論與結果

氮是影響微生物活動的關鍵，竹屑添加氮源調節(jié)碳氮比能促進堆體的發(fā)酵腐熟，改善物料的理化性質，適宜大球蓋菇生長[13]。溫度是判斷發(fā)酵腐熟程度的直觀指標，試驗中麥麩和菜籽餅的處理均達到了有效腐熟標準(50 ℃≥7 d)，但麥麩處理到達高溫后溫度下降較快，菜籽餅溫度下降速度相對較慢，可能是因為麥麩處理的添加量較大，孔隙度大，熱量易散失。尿素和玉米粉處理無法達到有效發(fā)酵高溫，可能是因為添加的質量分數較少，呈粉末狀溶于水后易流失，同時尿素作為非蛋白氮源會抑制微生物的活動[14]。

孔隙度是判斷發(fā)酵效果和決定菌絲生長的重要物理指標，竹屑的蠟質導致其持水性較差，發(fā)酵能夠增大竹屑的持水孔隙度，提升培養(yǎng)料的持水性[13]。菜籽餅添加處理的持水孔隙度最高(27.97%)，氣水比(1.80)顯著低于CK，說明發(fā)酵腐熟效果較好，這與用溫度判斷的結果相一致，但與稻草、農作物秸稈、菇渣等基質的持水性相比仍然較低[15]。相關性分析表明，總孔隙度與菌絲生長速度呈極顯著正相關，持水孔隙度與菌絲生長速度和長勢均呈極顯著正相關。這說明食用菌菌絲體的生長需要培養(yǎng)料良好的透氣與持水能力，持水性是制約竹屑用作食用菌基質的關鍵因素，如何提高竹屑的持水性，使其適用于食用菌栽培，有待進一步研究。

竹屑發(fā)酵能夠降低堆體的pH，增大EC[16]。大球蓋菇菌絲長勢與pH呈顯著負相關，可能是因為大球蓋菇適宜在弱酸性環(huán)境中生長，這與閆培生等利用PDA培養(yǎng)基試驗得出大球蓋菇最適宜pH為6～7的結果基本一致[17]。EC與菌絲生長速度和生長勢呈弱相關，說明大球蓋菇在試驗范圍(212.00～394.00 us·cm-1)內均可正常生長，未產生明顯毒害或抑制現象。

發(fā)酵將大分子有機物分解，形成腐殖質，改善物料的養(yǎng)分條件。大球蓋菇生長指標與堆體的有機碳、全磷、全鉀含量弱相關，這說明在各處理的全磷(1.48%～12.35%)和全鉀(0.15%～0.25%)范圍內對大球蓋菇生長不構成限制或促進作用。菌絲生長狀況最好的菜籽餅處理后的竹屑可溶性糖含量最高，顯著高于其他處理；同時可溶性糖與大球蓋菇菌絲長勢和生長速度極顯著正相關，這可能是因為可溶性糖作為易被利用的碳，給予大球蓋菇菌絲生長的啟動營養(yǎng)，從而促進大球蓋菇菌絲生長。C/N是食用菌培養(yǎng)料關鍵，同時也是判斷發(fā)酵腐熟程度的有效值指標[10]，不同食用菌對C/N的適應性不同[18-19]。添加菜籽餅處理的有效高溫時間最長，微生物活動最強烈，終止發(fā)酵時其C/N最低(44.02)，菌絲長勢和生長速度最佳。相關性分析表明，大球蓋菇菌絲生長速度和長勢與C/N呈極顯著負相關，與全氮和水解性氮呈極顯著正相關。這與繆曉丹等[20]利用谷殼、稻草和廢菌糠復配得出相似的結論，C/N為48.37的配方擁有最高的生物學效率和蛋白質含量。

該實驗測定了竹屑添加不同氮源發(fā)酵后的理化性質，并接種大球蓋菇進行了菌絲生長實驗，吳一凡等[6]研究表明大球蓋菇的菌絲生長速度和生長勢與產量品質呈顯著正相關。未來可進行栽培試驗，進一步研究大球蓋菇的營養(yǎng)生理，驗證不同氮源與大球蓋菇產量、品質的關聯性。

綜上，竹屑作為大球蓋菇基質的最佳發(fā)酵添加氮源是菜籽餅，添加4%菜籽餅的竹屑發(fā)酵過程中有最長的有效高溫(>50 ℃，14 d)，并建議堆制28 d以上。添加菜籽餅發(fā)酵后的竹屑持水性、全氮、水解性氮和可溶性糖含量顯著高于其他處理，C/N為44.02，接種大球蓋菇后菌絲潔白粗壯長勢最佳，生長速度最快(3.24 mm·d-1)。