MiR-211-5p在原發(fā)性高血壓患者血清中的表達及對血管內(nèi)皮細胞凋亡和炎性反應的影響

王丹，王瑤瑤，瞿金念，謝相屹

高血壓是臨床常見疾病，分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種，原發(fā)性高血壓占比高達50%以上，好發(fā)于60歲以上老年人，病因至今尚未完全闡明[1,2]。長期患有高血壓可造成體內(nèi)多個器官產(chǎn)生損害（如心、腦、腎臟、血管等），嚴重者可引起死亡[3]。AngⅡ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的活性物質(zhì)，能夠誘導血壓升高[4]，對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVECs）具有調(diào)節(jié)作用，具有促進HUVECs增殖、遷移和血管形成等作用[5]。miRNA是單鏈小分子RNA，不能編碼蛋白質(zhì)，廣泛存在哺乳動物中，通過靶向結(jié)合mRNA 3'非翻譯區(qū)，參與心血管疾病、腫瘤等發(fā)展[6,7]。越來越多的研究結(jié)果顯示，miRNA與高血壓發(fā)展密切相關(guān)[8]，如miR-211-5p在自發(fā)性高血壓大鼠中表達下調(diào)[9]，具體研究目前尚無明確報道。在線軟件預測顯示，EGR1是miR-211-5p靶基因之一，此前報道顯示，EGR1在肺動脈高血壓患者中表達上調(diào)[10]，miR-124-3p通過下調(diào)EGR1表達抑制AngⅡ誘導的HUVECs凋亡和氧化應激，促進細胞增殖和轉(zhuǎn)移[11]。因此，研究采用AngⅡ誘導HUVECs建立細胞損傷模型，探究miR-211-5p在原發(fā)性高血壓患者血清中的表達以及對AngⅡ誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡和炎性反應的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑HUVECs購自美國ATCC公司；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；AngⅡ購自美國Sigma公司；miR-NC、miR-211-5p、pcDNA、EGR1、引物由上海生工設(shè)計合成；Lipofectamine 2000試劑盒購自上海研卉生物公司；Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自賽默飛公司；CCK8試劑盒、凋亡試劑盒購自北京索萊寶公司；Cleaved cas-3抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、EGR抗體1、GAPDH購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購自武漢艾美捷科技；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒、白介素-1β（IL-1β）試劑盒購自上海江萊生物公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 樣本收集選取2019年12月至2021年5月于貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科確診為原發(fā)性高血壓患者30例，年齡57～83歲，男性17例，女性13例，原發(fā)性高血壓診斷標準：坐位收縮壓（SBP）≥140 mmHg、舒張壓（DBP）≥90 mmHg（1 mmHg=0.133kPa）。排除標準：繼發(fā)性高血壓者；慢性腎病者；心肺衰竭者；癌癥等。另選取21例在本院體檢的人群作為健康對照，年齡44～72歲，男性10例，女性11例。本研究已獲我院倫理委員會批準同意，患者及家屬對本研究均知情同意。

1.3 細胞培養(yǎng)和分組HUVECs用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)期HUVECs接種到96孔板中，×106mol/ml的AngⅡ干預細胞，干預前按Lipofectamine 2000試劑盒說明書將miRNC、miR-211-5p、miR-211-5p和pcDNA、miR-211-5p和EGR1轉(zhuǎn)染至HUVECs中，記為AngⅡ組、AngⅡ+miR-NC組、AngⅡ+miR-211-5p組、AngⅡ+miR-211-5p+pcDNA組、AngⅡ+miR-211-5p+EGR1組，其中正常培養(yǎng)細胞作為Control組。

1.4 qRT-PCR檢測miR-211-5p、EGR1 mRNA表達水平收集健康對照血清、原發(fā)性高血壓患者血清以及培養(yǎng)48 h各組HUVECs，用Trizol法提取細胞總RNA，檢測定量濃度后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA作為模板，按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書步驟進行擴增反應。反應條件為95℃預變性30 s，95 ℃反應5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。以U6、GAPDH作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算miR-211-5p、EGR1 mRNA表達水平。miR-211-5p正向引物：5'-GATGCT GTAATGGATGATATGA-3'，反向引物：5'-AT TGGAACGATACAGAGAAGATT-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。EGR1正向引物：5'-ACTTAAAGGACAGGAGGAGGAGATGG-3'，反向引物：5'-AGGGAGGACTTGGCTCTGAG AAC-3'；GAPDH正向引物：5'-ACCCACTCCTCC ACCTTTGAC-3'，反向引物：5'-TGTTGCTGTAG CCAAATTCGTT-3'。

1.5 CCK8法檢測細胞增殖活性收集對數(shù)期HUVECs，按照1.3法處理細胞接種96孔板中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀檢測450 nm處檢測細胞光密度值（A），細胞活性（%）=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡收集培養(yǎng)48 h各組HUVECs使用預冷緩沖液洗滌細胞3次，將5 μl的Annexin V FITC和PI試劑添加到500 μl細胞懸液內(nèi)，混勻后避光反應15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 Western blot檢測Cleaved cas-3、Bax、Bcl-2、EGR1蛋白表達收集培養(yǎng)48 h各組HUVECs加入150 μl RIPA裂解液，置于冰上反應30 min，提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，取蛋白樣品置于10%SDS-PAG凝膠電泳內(nèi)分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉90 min，加入Cleaved cas-3、Bax、Bcl-2、EGR1、GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜，室溫加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育90 min，用ECL顯色、曝光。以GAPDH抗體，Quantity One分析條帶的密度值。

1.8 ELISA法檢測TNF-α、IL-1β表達收集培養(yǎng)48 h各組HUVECs，4 ℃、12 000 r/min離心15 min收集細胞上清液，利用TNF-α試劑盒、IL-1β試劑盒說明書步驟，檢測TNF-α、IL-1β表達。

1.9 雙熒光素酶實驗檢測miR-211-5p、EGR1靶向關(guān)系在線軟件預測miR-211-5p、EGR1存在互補結(jié)合位點，而后構(gòu)建EGR1 3'UTR的突變型熒光素酶載體和野生型熒光素酶載體（EGR1 MUT、EGR1 WT），而后分別于miR-NC或miR-211-5p共轉(zhuǎn)染至HUVECs中，轉(zhuǎn)染48 h，采用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計學分析用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-211-5p在原發(fā)性高血壓患者血清中的表達與健康對照比較，原發(fā)性高血壓患者血清中miR-211-5p表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表1。

表1 miR-211-5p在原發(fā)性高血壓患者血清中的表達

2.2 過表達miR-211-5p對AngⅡ誘導HUVECs增殖活性和凋亡的影響與Control組比較，AngⅡ組中miR-211-5p表達水平、細胞活性、Bcl-2蛋白表達顯著降低，凋亡率、Cleaved cas-3、Bax蛋白表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與AngⅡ+miR-NC組比較，AngⅡ+miR-211-5p組中miR-211-5p表達水平、細胞活性、Bcl-2蛋白表達顯著增加，凋亡率、Cleaved cas-3、Bax蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），圖1及表2。

表2 過表達miR-211-5p對AngⅡ誘導HUVECs增殖活性和凋亡的影響

圖1 過表達miR-211-5p對AngⅡ誘導HUVECs凋亡的影響

2.3 過表達miR-211-5p對AngⅡ誘導HUVECs炎性反應的影響與Control組比較，AngⅡ組中TNF-α、IL-1β表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與AngⅡ+miR-NC組比較，AngⅡ+miR-211-5p組中TNF-α、IL-1β表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表3。

表3 過表達miR-211-5p對AngⅡ誘導HUVECs炎性反應的影響

2.4 miR-211-5p調(diào)控EGR1表達StarBase在線數(shù)據(jù)庫預測顯示，miR-211-5p和EGR1存在互補結(jié)合位點，圖2。與miR-NC組相比，miR-211-5p組中EGR1 MUT熒光素酶活性沒有顯著變化，EGR1 WT熒光素酶活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表4。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖2 miR-211-5p和EGR1存在互補結(jié)合位點

2.5 轉(zhuǎn)染miR-211-5p后EGR1表達與Control組比較，AngⅡ組中EGR1 mRNA和蛋白表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與AngⅡ+miR-NC組比較，AngⅡ+miR-211-5p組中TEGR1 mRNA和蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），圖3及表5。

表5 轉(zhuǎn)染miR-211-5p后EGR1表達

圖3 轉(zhuǎn)染miR-211-5p后EGR1蛋白表達

2.6 上調(diào)EGR1可逆轉(zhuǎn)過表達miR-211-5p對AngⅡ誘導HUVECs增殖活性、凋亡和炎性反應的影響與AngⅡ+miR-211-5p+pcDNA組比較，AngⅡ+miR-211-5p+EGR1組中EGR1 mRNA及蛋白表達水平、凋亡率、Cleaved cas-3、Bax蛋白表達顯著增加，細胞活性、Bcl-2蛋白表達顯著降低，TNF-α、IL-1β表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），圖4及表6。

圖4 上調(diào)EGR1可逆轉(zhuǎn)過表達miR-211-5p對AngⅡ誘導HUVECs凋亡的影響（A：凋亡圖；B：凋亡相關(guān)蛋白表達）

表6 上調(diào)EGR1可逆轉(zhuǎn)過表達miR-211-5p對AngⅡ誘導HUVECs增殖活性、凋亡和炎性反應的影響

3 討論

多數(shù)研究結(jié)果顯示，AngⅡ誘導HUVECs常用于建立高血壓損傷模型[12,13]。血管內(nèi)皮損傷是引起高血壓在內(nèi)的心血管疾病的重要原因之一[14]，細胞凋亡、炎性反應與血管內(nèi)皮損傷密切相關(guān)[15]。本研究AngⅡ誘導HUVECs建立高血壓細胞損傷模型，結(jié)果顯示，AngⅡ抑制HUVECs增殖，促進細胞凋亡和炎性反應，提示模型構(gòu)建成功。

近年研究結(jié)果顯示，miRNA與血管內(nèi)皮細胞損傷密切相關(guān)[16]，如miR-384在AngⅡ處理的HUVECs中低表達，過表達miR-384能抑制AngⅡ處理的HUVECs凋亡和氧化應激[17]。Luo等[18]研究結(jié)果顯示，miR-590-5p在AngⅡ處理的HUVECs中低表達，miR-590-5p通過下調(diào)LOX-1表達抑制AngⅡ處理的HUVECs凋亡和氧化應激。miR-211-5p在肺動脈高血壓、舌鱗狀細胞癌、骨關(guān)節(jié)炎等低表達[9,19,20]，可參與細胞增殖、凋亡和炎癥反應等過程。但是miR-211-5p在原發(fā)性高血壓及AngⅡ誘導HUVECs的研究尚不清楚，鑒于此，本研究主要觀察miR-211-5p在原發(fā)性高血壓患者血清中的表達及對AngⅡ誘導HUVECs增殖活性、凋亡和遷移的影響。研究結(jié)果顯示，miR-211-5p表達水平在原發(fā)性高血壓患者血清和AngII誘導HUVECs中低表達，提示miR-211-5p可能與高血壓發(fā)展有關(guān)。將過表達miR-211-5p轉(zhuǎn)染AngⅡ誘導HUVECs內(nèi)，結(jié)果顯示細胞活性、Bcl-2蛋白表達增加，凋亡率、Cleaved cas-3、Bax蛋白表達降低，TNF-α、IL-1β表達降低，提示過表達miR-211-5p可抑制AngⅡ誘導HUVECs損傷。

EGR1是即刻早期基因家族成員，位于人的染色體5q23-q31區(qū)域，廣泛存在人體器官內(nèi)，在癌癥、免疫疾病和心血管疾病中廣泛表達[21-23]。在心肌纖維化小鼠模型中，EGR1在心肌纖維化細胞中高表達，敲低EGR1改善了心機纖維環(huán)嚴重程度，抑制細胞凋亡[24]。還有研究結(jié)果顯示，miR-217負調(diào)節(jié)EGR1表達抑制ox-LDL誘導的主動脈內(nèi)皮細胞炎性損傷[25]。在線軟件預測顯示，miR-211-5p和EGR1存在互補結(jié)合位點，雙熒光素酶報告實驗和qRT-PCR實驗均驗證miR-211-5p調(diào)控EGR1表達。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AngⅡ誘導HUVECsEGR1 mENA和蛋白表達升高，過表達miR-211-5p降低EGR1 mENA和蛋白表達，說明miR-211-5p負調(diào)控EGR1表達。進一步實驗結(jié)果顯示，上調(diào)EGR1可逆轉(zhuǎn)過表達miR-211-5p對AngⅡ誘導HUVECs增殖活性、凋亡和炎性反應的影響，提示miR-211-5p負調(diào)控EGR1表達制AngⅡ誘導HUVECs損傷。

綜上所述，原發(fā)性高血壓患者血清內(nèi)miR-211-5p低表達，過表達miR-211-5p可減輕AngⅡ誘導HUVECs凋亡和炎性反應，其作用機制可能與EGR1表達有關(guān)。