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    HBV X 區(qū)A1762T/G1764A 突變對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及PI3K/AKT/mTOR 信號通路的影響

    2022-03-27 19:22:36于飛楊育華趙陽黃天壬
    中國典型病例大全 2022年6期
    關(guān)鍵詞:肝癌

    于飛 楊育華 趙陽 黃天壬

    摘要:目的:探究HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變對人肝癌HepG2細(xì)胞磷脂酰肌醇-3-激酶(the phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(serine/threonine protein kinase B, AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路的影響。方法:體外培養(yǎng)人肝癌 HepG2細(xì)胞;將HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為慢病毒空白載體(陰性對照)組、HBX-wt(野生型)組,HBX-A1762T/G1764A(實驗)組。實時熒光定量 PCR(RT-qPCR)法檢測各組細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR的表達(dá)情況;蛋白印跡分析法檢測各組細(xì)胞磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)表達(dá)情況。CCK8和平板克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖情況,Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲情況。結(jié)果:與陰性對照組和HBX-wt組相比,HBX-A1762T/G1764A組PI3K AKT、mTOR基因表達(dá)水平升高(P<0.05);p-AKT及p-mTOR水平升高(P<0.05);HBX-A1762T/G1764A組HepG2細(xì)胞增殖速率、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)升高(P<0.05)。結(jié)論:HBVX區(qū)A1762T/G1764A雙突變可能調(diào)控了肝癌HepG2激活了PI3K/AKT/mTOR信號通路,同時增強(qiáng)了HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。HBVX區(qū)A1762T/G1764A突變可能是HBV所致HCC診斷和治療的潛在靶點。

    關(guān)鍵詞:肝癌,HBV,HBX區(qū)A1762T/G1764A突變,PI3K/AKT/mTOR

    【中圖分類號】R735.7 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1673-9026(2022)06--02

    肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC簡稱肝癌)是世界最常見的惡性腫瘤之一。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)慢性感染是HCC發(fā)生的主要危險因素。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示,全球HCC病例中大約53%與HBV感染有關(guān)[1],其中95%以上的感染者有不同程度的HBV突變[2]。HBx由HBV的X開放閱讀框編碼,在肝癌的發(fā)生過程中起著至關(guān)重要的作用[3]。HBx還可以促進(jìn)HBV的復(fù)制,調(diào)節(jié)生物過程,如宿主基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期進(jìn)程和氧化應(yīng)激[4-6]。結(jié)合國內(nèi)外研究進(jìn)展與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),HBV X 區(qū)的A1762T/G1764A突變?yōu)橛胁町惖臒狳c突變,差異有統(tǒng)計學(xué)意義[7]。

    PI3K/AKT/mTOR信號通路在生理和病理條件下對細(xì)胞生長和存活的許多方面都是十分重要的[9]。本研究在體外建立了人肝癌細(xì)胞HBX突變模型,以探討HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變對人肝癌HepG2細(xì)胞株增殖、遷移和侵襲及PI3K/AKT/mTOR通路影響,為肝癌治療提供可能的新靶點。

    1 材料與方法

    1.1主要材料與試劑

    人肝癌HepG2細(xì)胞株,課題組前期購買。特級澳洲胎牛血清、DMEM高糖型細(xì)胞培養(yǎng)基:美國Gbico公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及qRT-PCR試劑盒:日本TaKaRa 公司。慢病毒表達(dá)載體HBX-A1762T/G1764A突變組、HBx野生型組、陰性對照組。HBX、PI3K、AKT、mTOR基因引物:上海生工生物工序股份有限公司。乙型肝炎病毒X多克隆抗體:美國Abcam公司。beta-ActinRabbit mAb、PI3Kinase plloalpha Rabbit mAb、Phospho-PI3 Kinase Rabbit mAb、AKT Rabbit mAb、p-AKTRabbitmAb、mTORRabbitmAb、p-mTORRabbitmAb:美國CST公司。

    1.2 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染

    HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖型細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中。待細(xì)胞密度約為30%-50%時,按慢病毒使用說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實驗分組:(1)轉(zhuǎn)染慢病毒空白載體的陰性對照組(NC),轉(zhuǎn)染含HBX野生基因型序列的野生型組(WT),轉(zhuǎn)染含HBX野生基因序列發(fā)生A1762T/G1764A位點聯(lián)合突變的實驗組(EG)。

    1.3? RT-qPCR實驗檢測HBX、PI3K、AKT、mTOR的表達(dá)

    按照Trizol試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄得cDNA,然后按照qRT-PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:95 °C變性10min,60°C退火 30s、72 °C延伸 40min,共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計算HBX、PI3K、AKT、mTOR表達(dá)水平。引物序列見表1。

    1.4Western blot檢測HBx、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)

    收集各組細(xì)胞,加入RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白。取30μg蛋白樣品行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜、快速封閉液封閉后,加入一抗HBx、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、β-actin (1∶1 000), 4℃搖床孵化過夜;次日洗膜后加入1∶2000稀釋的山羊抗兔IgG作為二抗,室溫孵化1 h,TBST洗滌后,加入ECL顯色發(fā)光,凝膠成像儀成像。以為β-actin內(nèi)參, Image J軟件測定蛋白灰度值,計算各組各蛋白相對表達(dá)量。

    1.5CCK-8實驗檢測細(xì)胞的增殖能力

    將各組細(xì)胞接種至96孔板中常規(guī)培養(yǎng),每組設(shè)置5個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24h、48h、72h時,向每孔加入CCK-8試劑,于37℃培養(yǎng)箱中孵育2h后,使用多功能酶標(biāo)儀檢測450nm波長處的光密度(OD)值。

    1.6平板克隆形成實驗檢測細(xì)胞的增殖能力

    將各組細(xì)胞接種至6孔板(約1000/孔)中,每組設(shè)置3個復(fù)孔。加入2m L完全培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔4~5d更換1次培養(yǎng)基。培養(yǎng)11~15d后,當(dāng)孔中出現(xiàn)肉眼可見細(xì)胞克隆球時,棄去培養(yǎng)基,PBS清洗后,用4%多聚甲醛固定20min,0.1%結(jié)晶紫染色10min,洗去染色液,室溫干燥。拍照并計數(shù)各孔中的克隆球(>50細(xì)胞)數(shù)目。

    1.7Transwell小室實驗檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力

    使用Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實驗。對于侵襲實驗,預(yù)先在Transwell小室上室鋪被基質(zhì)膠。將各組細(xì)胞接種至Transwell小室上室(約8×105/孔),培養(yǎng)基體積為300μL,不含血清;下室加入700μL含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃孵育48h后取出小室,用4%多聚甲醛固定20min,用0.1%結(jié)晶紫染色10min,用棉簽拭去小室內(nèi)表面細(xì)胞。在顯微鏡下觀察并計算5個隨機(jī)視野中的細(xì)胞數(shù)。

    1.8統(tǒng)計學(xué)方法

    以統(tǒng)計學(xué)軟件GraphPad Prism 8.0分析實驗數(shù)據(jù)并進(jìn)行繪圖,計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差() 描述,多組間比較使用單因素方差分析,進(jìn)一步兩組間比較行LSD-t檢驗,當(dāng)P<0.05時,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2? 結(jié)果

    2.1HepG2細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染驗證

    將提取的總蛋白進(jìn)行Western blot分析,結(jié)果如圖1所示:陰性對照轉(zhuǎn)染組未見任何條帶,而HBX-wt、HBX-A1762T/G1764A組在相對分子質(zhì)量約為17KD處存在顯著條帶,見圖1。以上結(jié)果說明成功構(gòu)建了HepG2細(xì)胞模型。

    2.2 HBX突變對HepG2細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR通路基因表達(dá)的影響

    與陰性對照組和HBX-wt組相比,HBX-A1762T/G1764A組細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05);與陰性對照組相比,HBX-wt組PI3K、AKT、mTOR的表達(dá)水平也均升高(P<0.05),見表1。

    Note:Compared with negative control group, aP<0.05. Compared with HBX-wt, bP<0.05. Three independent repeated experiments.

    2.3 HBXA1762T/G1764A突變對HepG2細(xì)胞p-PI3K、p-AKT 及 p-mTOR表達(dá)情況表達(dá)的影響

    與陰性對照組和HBX-wt組相比,HBX-A1762T/G1764A組細(xì)胞p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與陰性對照組相比,HBX-wt組p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的表達(dá)水平升高(P<0.05);與陰性對照組相比,HBX-A1762T/G1764A組細(xì)胞p-PI3K/ PI3K表達(dá)水平升高(P<0.01),見圖1。

    2.4HBX A1762T/G1764A突變對HepG2細(xì)胞增值、遷移和侵襲的影響

    CCK-8實驗結(jié)果顯示,HBX-A1762T/G1764A組細(xì)胞增殖速率增高(F24 h=106.3,P<0.01;F48 h=364.7,P<0.01;F72 h=183.4,P<0.01),平板克隆形成數(shù)目增多(F=58.96,P<0.01),提示HBX A1762T/G1764A突變可促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖,見圖2、圖3。Transwell小室實驗顯示,HBX-A1762T/G1764A組細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)增多(F=59.28, P<0.01;F=44.35, P<0.01),提示HBX A1762T/G1764A突變可促進(jìn)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲,見圖4。

    3? 討論

    在所有誘導(dǎo) HCC 的因素中, HBV慢性感染最為常見和重要。長期 HBV 感染的人患 HCC 的風(fēng)險可能會增加5至15倍[10]。因此,探究 HBV 在 HCC 發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制,并在此基礎(chǔ)上尋找有效的措施防治HCC尤為重要。由于HBV復(fù)制過程的特點導(dǎo)致HBV DNA基因變異率較一般DNA病毒高10倍左右[11]。

    PI3K/AKT通路是細(xì)胞應(yīng)激期間的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。由于腫瘤存在于內(nèi)在的壓力環(huán)境中,例如營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)不足等,在此類環(huán)境下這一途徑在癌癥的發(fā)生發(fā)展中有著關(guān)鍵作用。mTOR是一種在哺乳動物細(xì)胞中普遍表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸激酶。它拾取并整合各種細(xì)胞刺激啟動的信號,以調(diào)節(jié)下游信號和蛋白質(zhì)合成。它的激活導(dǎo)致細(xì)胞生長和存活調(diào)控的嚴(yán)重紊亂,最終導(dǎo)致競爭生長優(yōu)勢、轉(zhuǎn)移能力、血管生成和治療耐藥[9]。本研究發(fā)現(xiàn),與陰性對照組、HBX-wt組相比,HBX-A1762T/G1764A組HepG2細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR基因表達(dá)量均升高,p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的表達(dá)水平均顯著升高。與此同時HBX-A1762T/G1764A組HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲也均增強(qiáng)。提示HBX的A1762T/G1764A雙突變可能在HBV所致的HCC中起到了一定的促進(jìn)作用。

    綜上所述HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變可能通過磷酸化PI3K/AKT信號通路中的AKT,上調(diào)mTOR的表達(dá),并增強(qiáng)了HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,從而可能促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展。

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    基金項目:廣西自然科學(xué)基金資助(編號:2019GXNSFDA245001)

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