赤霉素及其抑制劑調(diào)控草地早熟禾生長(zhǎng)及赤霉素相關(guān)基因表達(dá)的研究

趙利清，郝志剛，崔笑巖，彭向永*

（1. 國(guó)家開放大學(xué)，北京 100039；2. 銀河生態(tài)科技有限公司，北京 102488；3. 曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165）

草坪具有保持水土、降溫增濕、美化環(huán)境等多種功能，對(duì)維護(hù)城市生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有非常重要的作用。但草坪草的生長(zhǎng)速度快、分蘗能力強(qiáng)，在生長(zhǎng)季節(jié)需要多次修剪才能夠保持草坪的平整和優(yōu)美，給園林養(yǎng)護(hù)增加了巨大的人力、物力和財(cái)力成本［1］。赤霉素（gibberellin，GA）是一類含四環(huán)雙萜結(jié)構(gòu)的植物激素，能夠促進(jìn)植物細(xì)胞的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)［2］，植株的高度也被認(rèn)為與赤霉素密切相關(guān)［3］。而一些赤霉素的合成抑制劑如矮壯素、多效唑、烯效唑等則可抑制植物生長(zhǎng)高度。為了減少草坪修剪次數(shù)，降低管理成本，生產(chǎn)上使用矮壯素、多效唑等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑抑制草坪草的生長(zhǎng)高度［4］。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，這些抑制劑能提高草坪草抗逆性，延長(zhǎng)草坪使用年限，改善草坪質(zhì)量和景觀效果［5］。目前，關(guān)于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑調(diào)控草坪草生長(zhǎng)高度的報(bào)道較多，但大多從生長(zhǎng)和生理角度進(jìn)行研究，而在解剖及分子水平上的研究較少［6-7］。本研究以溫帶地區(qū)應(yīng)用廣泛的草坪草—草地早熟禾（Poa pratensis）為材料，研究不同濃度的赤霉素及其兩種抑制劑對(duì)草坪草生長(zhǎng)、葉綠素含量及相關(guān)基因表達(dá)的影響，為草坪養(yǎng)護(hù)管理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

市售草地早熟禾種子，2019 年7 月在培養(yǎng)室中直播沙培育苗，室溫控制在20～25 ℃，自然光照。6 周后選生長(zhǎng)一致的2 葉齡幼苗，洗凈根部泥沙，用1/2Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每盆營(yíng)養(yǎng)液體積為9 L，每周更換1 次培養(yǎng)液，培養(yǎng)期間利用充氣泵連續(xù)充氣。在營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)6 周后，待植株長(zhǎng)到4～5 片成熟葉時(shí)開始試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別噴施赤霉素（GA3上海同瑞生物科技有限公司）、烯效唑（5%可濕性粉劑，江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司）和多效唑（15%可濕性粉劑，江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司）3 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑1 次。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果并參考相關(guān)文獻(xiàn)［1，8］確定濃度：50 和100 mg·L-1的赤霉素處理分別記作GA50和GA100，500（2000 mg·L-1）和1000 倍（1000 mg·L-1）烯效唑處理分別記作X500和X1000，500（2000 mg·L-1）和1000 倍（1000 mg·L-1）多效唑處理記 作D500和D1000，以噴施蒸餾水為對(duì)照CK。每處理3 個(gè)重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng)10 周，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)及生物量測(cè)定 葉長(zhǎng)、葉寬及根長(zhǎng)等生長(zhǎng)指標(biāo)用刻度尺直接測(cè)量。分別收獲葉片和根，用自來水沖洗表面，再用去離子水洗凈，吸干植株表面水分后稱鮮重；105 ℃下殺青0.5 h，75 ℃下烘干至恒重。計(jì)算干物質(zhì)含量（鮮重/干重×100%）和根冠比（根干重/枝葉干重）［9］。

1.3.2 葉綠素含量的測(cè)定［10］取草地早熟禾成熟葉片剪成細(xì)絲，采用80%丙酮避光提取法，721 分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，分別計(jì)算葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量。

1.3.3 葉綠體分布觀察［11］取成熟葉片的中部，制作徒手切片，奧林巴斯顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 赤霉素代謝相關(guān)基因表達(dá) 葉片總RNA 提取用RNAEasyspin Plant RNA Kit（Aidlab），使用PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）合成cDNA 第1 鏈，具體步驟參照說明書。根據(jù)水稻（Oryza sativa）、短柄草（Brachypodium distachyon）、玉米（Zea mays）的同源基因的保守序列，利用在線工具OligoArchitect?（http://www.sigmaaldrich.com）設(shè)計(jì)赤霉素代謝相關(guān)基因引物，以草地早熟禾β-tublin 作為內(nèi)參基因［12］，所有PCR 引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成（見表1）。LightCycler 480Ⅱ（Roche）熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系10 μL，包含cDNA 2 μL，2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa）5 μL，正反向引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，ddH2O 2.6 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 °C 30 s；95 °C 5 s，60 °C 30 s，40 個(gè)循環(huán)；60 °C 讀取熒光值；循環(huán)結(jié)束后95 °C 5 s，50 °C 30 s，最后進(jìn)行溶解曲線分析。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。

表1 草地早熟禾赤霉素代謝關(guān)鍵酶基因qRT-PCR 引物序列Table 1 Primer sequence of the key enzyme gene qRT-PCR for gibberellin metabolism in P.pratensis

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.5 和Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，Duncan 多重比較檢驗(yàn)（Duncans multiple range test）不同處理間的差異；單因素方差分析（one-way ANOVA）比較相同處理的平均值，數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)草地早熟禾生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

由表2 可知，與對(duì)照組比較，G100處理的植株葉長(zhǎng)和根長(zhǎng)分別顯著增加了35%和21%（P＜0.05），但葉寬無顯著差異；抑制劑X500、X1000、D500和D1000處理的草地早熟禾葉長(zhǎng)、葉寬及根長(zhǎng)均下降，其中葉長(zhǎng)達(dá)到了極顯著差異水平（P＜0.01），葉寬及根長(zhǎng)達(dá)到顯著差異水平（P＜0.05），但不同抑制劑及濃度處理之間無顯著差異。結(jié)果表明，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑均能調(diào)控草地早熟禾的葉長(zhǎng)、葉寬及根長(zhǎng)等生長(zhǎng)指標(biāo)。

表2 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)草地早熟禾生長(zhǎng)指標(biāo)的影響Table 2 Effects of growth regulators on growth indices of P.pratensis

2.2 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)草地早熟禾鮮/干物質(zhì)積累的影響

表3 顯示，與對(duì)照比較，G50和G100處理的草地早熟禾根鮮重分別升高了22%和23%，葉鮮重分別升高了28%和58%，葉干重和根干重上升，均達(dá)到了顯著差異水平（P＜0.05），但葉和根的干物質(zhì)含量無顯著差異。抑制劑X500、X1000、D500和D1000處理的葉鮮重分別下降了30%、42%、32%和41%，達(dá)到了顯著差異水平（P＜0.05），根鮮重分別顯著下降了28%、34%、26%和26%，葉干重和根干重也均下降，達(dá)到了顯著差異水平（P＜0.05），但根的干物質(zhì)含量顯著高于對(duì)照（P＜0.05）。計(jì)算草地早熟禾的根冠比發(fā)現(xiàn)，G50和G100處理的根冠比均下降，X500、X1000、D500和D1000處理的根冠比則分別比對(duì)照升高了47%、67%、53%和60%，均達(dá)到顯著差異水平（P＜0.05）。結(jié)果說明植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑均能夠影響草地早熟禾葉片及根的干物質(zhì)積累量。

表3 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)草地早熟禾鮮/干物質(zhì)積累的影響Table 3 Effects of growth regulators on fresh/dry matter accumulation of P.pratensis

2.3 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)草地早熟禾色素含量的影響

表4 顯示，G50和G100處理的葉綠素a 和葉綠素b含量比對(duì)照略有升高，但無顯著差異，抑制劑X500、X1000、D500和D1000處理的葉綠素a 比對(duì)照分別顯著升高了38%、35%、28%和33%，葉綠素b 分別顯著升高了13%、13%、16%和21%（P＜0.05）。G50處理的類胡蘿卜素含量與對(duì)照無顯著差異，但G100處理卻顯著升高了21%，4 種抑制劑處理的草地早熟禾葉片中類胡蘿卜素含量均顯著高于對(duì)照（P＜0.05），但不同抑制劑及濃度處理之間無顯著差異。結(jié)果說明植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑均能夠影響草地早熟禾葉片中的色素含量。

表4 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)草地早熟禾色素含量的影響Table 4 Effects of growth regulators on pigments content of P.pratensis

2.4 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)草地早熟禾葉片中葉綠體分布的影響

對(duì)照、G50和G100處理的葉片中葉綠體呈不均勻分布，多數(shù)分布在靠近上下表皮的葉肉細(xì)胞中，且上表皮附近分布的葉綠體略微多于下表皮，而葉片中部的葉肉細(xì)胞中幾乎無葉綠體分布（圖1a～c）。抑制劑X500、X1000、D500和D1000處理的葉片中，葉肉細(xì)胞變小，層數(shù)增加，葉綠體分布均勻，充滿了葉片上下表皮之間的葉肉細(xì)胞中，葉片中部無明顯的葉綠體分布空心區(qū)域，且葉綠體分布的密度明顯高于對(duì)照及赤霉素處理組（圖1d～g）。說明不同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理不僅影響了草地早熟禾葉片中的葉綠體分布，而且也會(huì)影響葉綠體含量。

圖1 草地早熟禾葉片橫切面的徒手切片F(xiàn)ig.1 Free-hand sections of the leaves of P. pratensis

2.5 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)草地早熟禾赤霉素相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖2 顯示，與對(duì)照比較，G50和G100處理下，赤霉素合成途徑中兩個(gè)關(guān)鍵酶基因PpKAO和PpKS1的表達(dá)量下調(diào)；與活性赤霉素合成相關(guān)的基因PpGA20ox和PpGA3ox表達(dá)量均下調(diào)；但與活性赤霉素分解相關(guān)的PpGA2ox基因表達(dá)量達(dá)到了對(duì)照的4.6 和4.2 倍；赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的GA 受體蛋白PpGID1基因則顯著下調(diào)表達(dá)（P＜0.05）。抑制劑X500、X1000、D500和D1000處理的赤霉素合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照，僅信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白受體基因PpGID1顯著上調(diào)表達(dá)（P＜0.05）。

圖2 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)草地早熟禾赤霉素相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of growth regulators on the expression of gibberellin-related genes in P. pratensis

3 討論

赤霉素是一類含四環(huán)雙萜結(jié)構(gòu)的植物激素，其最重要的生理功能之一就是促進(jìn)植物細(xì)胞的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)［3］，而赤霉素合成抑制劑如多效唑、烯效唑等則可抑制其發(fā)揮功效，它們作為重要的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育［13］。噴施外源赤霉素后，草地早熟禾葉片和根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，葉片和根的干/鮮重均升高，但根冠比下降（表2 和表3），這是因?yàn)槌嗝顾乜纱龠M(jìn)植物細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，體積增加，干物質(zhì)累積量升高的同時(shí)，細(xì)胞含水量也增加，使植株的鮮重和干重均上升；但葉片伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的比例卻遠(yuǎn)高于根系，導(dǎo)致根冠比下降。噴施烯效唑和多效唑?qū)χ仓晟L(zhǎng)具有顯著的抑制作用，且以干物質(zhì)量計(jì)算的根冠比卻顯著增加（表2 和表3），因?yàn)橄┬н蚝投嘈н蚴浅嗝顾睾铣梢种苿?，且?duì)葉片的抑制作用大于根系，植株細(xì)胞變小，含水量降低，干物質(zhì)相對(duì)含量升高，導(dǎo)致根冠比升高。這與西伯利亞翦股穎（Agrostis stolonifera）、黑麥草（Lolium perenne）等草坪草上的研究一致［14-15］。

本研究對(duì)葉片橫切面觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照及赤霉素處理組葉綠體多數(shù)分布在靠近上下表皮的葉肉細(xì)胞中，且上表皮附近分布的葉綠體略微多于下表皮，而葉片中部的葉肉細(xì)胞中幾乎無葉綠體分布（圖1a～c）；而赤霉素抑制劑處理的葉肉細(xì)胞變小，層數(shù)增加，葉綠體均勻分布在葉片上下表皮之間的葉肉細(xì)胞中，葉片中部無明顯的葉綠體分布空心區(qū)域，葉綠體數(shù)目顯著多于對(duì)照（圖1d～g）；抑制劑處理的草地早熟禾葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素的含量均升高（表4）。烯效唑和多效唑能夠顯著提高草坪草的葉綠素含量［6-7］，在形態(tài)解剖與理化水平上是一致的。

赤霉素生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育極其重要［16］。本研究中發(fā)現(xiàn)赤霉素處理后，PpKAO、PpKS1、PpGA20ox、PpGA3ox等基因的表達(dá)量均下調(diào)，而PpGA2ox基因顯著上調(diào)（圖2），說明赤霉素含量對(duì)赤霉素合成酶基因的表達(dá)具有反饋調(diào)節(jié)作用，這與在馬鈴薯（Solanum tuberosum）［17］、甜櫻桃（Prunus avium）［18］上的研究結(jié)果一致。X500、X1000、D500和D1000處理后，活性赤霉素合成途徑相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)一步下調(diào)（圖2），表明它們可通過抑制赤霉素的合成或分解活性赤霉素而減少植株體內(nèi)活性赤霉素含量，抑制植株的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，赤霉素處理后的PpGID1下調(diào)表達(dá)，而赤霉素抑制劑處理后則顯著上調(diào)表達(dá)，說明赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控也具有重要意義［19-20］。

4 結(jié)論

與赤霉素的效應(yīng)恰好相反，烯效唑、多效唑均可抑制草地早熟禾的生長(zhǎng)，降低干物質(zhì)積累，提高葉片中葉綠素含量和根冠比，影響葉綠體的分布和赤霉素合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的相關(guān)基因表達(dá)，但未表現(xiàn)明顯的濃度效應(yīng)。實(shí)際生產(chǎn)中，在草坪修剪后立即噴施1000 倍的烯效唑或多效唑，可抑制植株生長(zhǎng)發(fā)育，提高葉綠素含量和根冠比，對(duì)減少用工成本，增加草坪觀賞性、提高園林綠化中的草坪草管護(hù)水平具有重要意義。