竹卵圓蝽致病球孢白僵菌的分離和毒力測(cè)定

耿顯勝，舒金平，張亞波，張 威，王浩杰

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400)

竹卵圓蝽（Hippotiscus dorsalis(St?l)）是廣泛分布于我國(guó)各竹產(chǎn)區(qū)的一種重要害蟲(chóng)。竹卵圓蝽的若蟲(chóng)和成蟲(chóng)在竹稈和竹枝的節(jié)上吸食汁液，致使被害枝條落葉枯死，嚴(yán)重者可致整株竹子死亡[1-2]。據(jù)2015 年統(tǒng)計(jì)，浙江省安吉縣毛竹林竹卵圓蝽的有蟲(chóng)株率在56.78%以上，單株最高蟲(chóng)口達(dá)到254頭，且近幾年來(lái)其危害呈上升的趨勢(shì)[3]。因此，竹卵圓蝽仍是我國(guó)部分竹產(chǎn)區(qū)高危險(xiǎn)性的害蟲(chóng)。

依據(jù)竹卵圓蝽群聚吸汁和越冬若蟲(chóng)上竹危害的生物學(xué)特性，我國(guó)學(xué)者提出了人工捕捉、粘蟲(chóng)膠帶粘蟲(chóng)、竹腔注射化學(xué)農(nóng)藥、噴撒化學(xué)農(nóng)藥等防治方法[4]。這些方法在短期內(nèi)取得較好的防治效果，但也存在很多不足。竹卵圓蝽的臭腺能分泌防御性化學(xué)物質(zhì)，這些化學(xué)物質(zhì)可引起人的皮膚發(fā)黃、起泡、潰瘍等癥狀，故人工捕捉竹卵圓蝽時(shí)常常會(huì)傷及作業(yè)人員?；瘜W(xué)農(nóng)藥的不合理使用，易產(chǎn)生害蟲(chóng)抗藥性增強(qiáng)、次要害蟲(chóng)爆發(fā)、環(huán)境污染、人畜中毒、林產(chǎn)品品質(zhì)下降等風(fēng)險(xiǎn)[5-8]。

生物防治具有靶標(biāo)性強(qiáng)、對(duì)人畜安全、環(huán)境兼容性好等優(yōu)點(diǎn)，是害蟲(chóng)綠色防控的重要措施。通過(guò)對(duì)竹卵圓蝽天敵昆蟲(chóng)的調(diào)查，已經(jīng)找到數(shù)種寄生性和捕食性的天敵昆蟲(chóng)[2,9-10]，但這些天敵昆蟲(chóng)在自然界中的數(shù)量有限，人工繁育技術(shù)不成熟，難以在生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用。昆蟲(chóng)病原真菌因其易于室內(nèi)大規(guī)模繁育、儲(chǔ)存和運(yùn)輸，施用技術(shù)簡(jiǎn)單，而成為最具開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用前景的生物防治制劑之一[7,11]。本研究通過(guò)組織分離法，從罹病的竹卵圓蝽體內(nèi)分離病原真菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)、DNA 條形碼相結(jié)合的方法對(duì)病原真菌進(jìn)行物種鑒定，采用生物測(cè)定法評(píng)價(jià)不同菌株的毒力，篩選出對(duì)竹卵圓蝽若蟲(chóng)具有高毒力的菌株，研究結(jié)果為竹卵圓蝽的生物防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 昆蟲(chóng)病原真菌的分離

作者于2017 年在浙江省杭州市富陽(yáng)區(qū)大源鎮(zhèn)毛竹（Phyllostachys edulis(Carrière) J.Houz.）竹稈上發(fā)現(xiàn)有死亡的竹卵圓蝽，且在死亡蟲(chóng)體表面長(zhǎng)出白色的菌絲，初步確定其被病原真菌侵染。將死亡蟲(chóng)體用鑷子從竹稈上取下，置于無(wú)菌的離心管中，每管1 頭，帶回實(shí)驗(yàn)室用于病原真菌的分離。

從離心管中取出蟲(chóng)體，放在流水下沖洗10 min，依次使用75%乙醇洗滌30 s，10%次氯酸鈉洗滌10 min，無(wú)菌水洗滌5 次。洗滌后的蟲(chóng)體轉(zhuǎn)移到無(wú)菌濾紙上，吸干表面殘留的水分，轉(zhuǎn)接到含鏈霉素（200 mg·L-1）的PDA 固體培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)，觀察病原真菌在PDA 培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀和生長(zhǎng)狀況。

1.2 昆蟲(chóng)病原真菌的物種鑒定

觀察并描述病原真菌在PDA 固體培養(yǎng)基上形成菌落的形態(tài)特征。在VHX5000 顯微鏡（KEYENCE公司，日本）下觀察病原真菌的菌絲和分生孢子，使用顯微鏡的測(cè)量軟件VHX-H2M2 測(cè)定分生孢子大小。參考Zimmermann 對(duì)昆蟲(chóng)病原真菌的形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀的描述[12]，對(duì)分離病原真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

采用DNA 條形碼的方法對(duì)病原真菌進(jìn)行分子鑒定[13]。用無(wú)菌吸頭從平板上刮取菌絲和分生孢子，置于2 mL 的無(wú)菌離心管中，在Tissue lyser-48 研磨儀上研磨粉碎，具體研磨步驟參考耿顯勝等的方法[14]。采用引物對(duì)ITS1/ITS4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[15-16]，PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2 × PCR Mix 10 μL，10 μmol·L-1的正、反向引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，加ddH2O 補(bǔ)足20 μL。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性35 s，57 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析，陽(yáng)性的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序序列使用DNAMAN 6.0 進(jìn)行多序列比對(duì)分 析，使 用NCBI（National Center for Biotechnology Information，NCBI）和BOLD（The Barcode of Life Data System，BOLD）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線比對(duì)分析。

1.3 昆蟲(chóng)病原真菌對(duì)竹卵圓蝽若蟲(chóng)的毒力測(cè)定

采用浸漬法測(cè)定分離菌株的毒力。選取生長(zhǎng)健壯且無(wú)雜菌污染的4 株昆蟲(chóng)病原真菌LYC4、LYC10、LYC11 和LYC15 轉(zhuǎn)接到PDA 固體培養(yǎng)基上，25 ℃下暗培養(yǎng)15 d，讓其產(chǎn)生足夠數(shù)量的分生孢子。刮取分生孢子，置于含0.05% Tween-80 的無(wú)菌水中，使用無(wú)菌玻棒將刮取的孢子塊分散成單個(gè)的分生孢子，使用金屬過(guò)濾器過(guò)濾除去菌絲和未分散開(kāi)的孢子塊。采用血球細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定孢子的濃度，用含0.05% Tween-80 的無(wú)菌水將分生孢子調(diào)成1 ×107和1 × 108孢子·mL-1的懸浮液。將竹卵圓蝽3 齡若蟲(chóng)置于分生孢子懸浮液中浸泡2 s，然后轉(zhuǎn)移到含濕潤(rùn)濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，并在培養(yǎng)皿中加入一段新鮮的毛竹竹稈，用于飼喂竹卵圓蝽若蟲(chóng)。每皿轉(zhuǎn)接竹卵圓蝽若蟲(chóng)6 頭，每個(gè)處理為4 皿。試驗(yàn)以含0.05% Tween-80 的無(wú)菌水浸泡的竹卵圓蝽3 齡若蟲(chóng)為對(duì)照處理組。接蟲(chóng)后的培養(yǎng)皿置于人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)13 d，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光周期10L:14D。

接蟲(chóng)后每天觀察竹卵圓蝽的活動(dòng)情況，統(tǒng)計(jì)死亡蟲(chóng)體的數(shù)量，計(jì)算逐日的累計(jì)死亡率和校正累計(jì)死亡率：

將校正累計(jì)死亡率轉(zhuǎn)換成死亡率概率值，統(tǒng)計(jì)的天數(shù)轉(zhuǎn)換成以10 為底的對(duì)數(shù)，采用SPSS24.0軟件進(jìn)行線性回歸分析，獲取回歸方程和決定系數(shù)，通過(guò)回歸方程計(jì)算出致死中時(shí)間LT50值。采用SigmaPlot 12.5 軟件制作校正累計(jì)死亡率的散點(diǎn)圖。

1.4 林間生物測(cè)定

室內(nèi)篩選出的高毒力菌株LYC11 轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基上，25 ℃下暗培養(yǎng)15 d。采用血球細(xì)胞計(jì)數(shù)法將分生孢子使用含0.05% Tween-80 的無(wú)菌水調(diào)制成5 × 107、1 × 107、1 × 106、1 × 105和1 ×104孢子·mL-1的懸浮液，用含0.05% Tween-80 的無(wú)菌水作為對(duì)照處理，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

在浙江省安吉縣成片毛竹林開(kāi)展生物測(cè)定。安吉縣位于浙江省西北部，處于北亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)。2019 年4 月，該縣天氣以陰雨天為主，月平均最高氣溫23 ℃，月平均最低氣溫12 ℃。在毛竹林捕捉聚集于竹稈上的竹卵圓蝽若蟲(chóng)，置于預(yù)先配制好的分生孢子懸浮液中浸泡5 s，取出后接于袖籠內(nèi)，袖籠套在毛竹竹稈上。接蟲(chóng)后第18 天，統(tǒng)計(jì)袖籠內(nèi)竹卵圓蝽的總數(shù)和死亡蟲(chóng)體數(shù)量，計(jì)算累計(jì)死亡率。采用SPSS24.0 軟件的Probit 回歸法獲取回歸方程和致死中濃度LC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆蟲(chóng)病原真菌的分離、培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定

本研究使用16 頭竹卵圓蝽僵蟲(chóng)進(jìn)行分離培養(yǎng)，共得到7 株昆蟲(chóng)病原真菌，7 株昆蟲(chóng)病原真菌的編號(hào)分別為L(zhǎng)YC4、LYC5、LYC6、LYC8、LYC10、LYC11 和LYC15。觀察分離菌株在PDA 固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀，該病原真菌在培養(yǎng)基的接種點(diǎn)處長(zhǎng)出菌落，菌落包圍接種的僵蟲(chóng)，初期菌落為白色絨毛狀，后期菌落呈淡黃色粉狀。將菌落置于顯微鏡下觀察，其菌絲體白色，分生孢子球形，直徑2.93±0.35 μm（圖1B），分生孢子常數(shù)百個(gè)聚集成致密的球狀體，球狀體白色，直徑34.13±5.06 μm（圖1A）。依據(jù)該菌的形態(tài)特征和在PDA固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀，參考Zimmermann 對(duì)球孢白僵菌（Beauveria bassiana(Balsamo)Vuillemin）的描述[12]，初步鑒定為球孢白僵菌。

圖1 竹卵圓蝽僵蟲(chóng)分離的球孢白僵菌形態(tài)特征Fig.1 The morphological characteristics of B.bassiana isolated from H.dorsalis

2.2 昆蟲(chóng)病原真菌的分子鑒定

采用引物對(duì)ITS1/ITS4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，7 個(gè)樣品都能夠擴(kuò)增出約600 bp 的特異性條帶（圖2），條帶的大小與預(yù)期一致。PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物測(cè)序和序列分析，得到7 個(gè)菌株530 bp 的ITS rDNA 序列。多序列比對(duì)表明，7 個(gè)菌株ITS rDNA 序列僅有1 個(gè)核苷酸位點(diǎn)的差異，同源性為99.97%。ITS rDNA 序列提交到DNA 條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)BOLD，進(jìn)行DNA 條形碼鑒定，所有7 株昆蟲(chóng)病原真菌均鑒定為球孢白僵菌。ITS rDNA 序列同時(shí)提交到NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)在線比對(duì)，結(jié)果表明，LYC4、LYC6、LYC8、LYC10、LYC11、LYC15 和LYC5菌株與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中球孢白僵菌（GenBank 登錄 號(hào)：MN122432、MK229193、MG345086、MK490863、MH367274、MN401662）ITS rDNA序列的同源性為100.00%。

圖2 球孢白僵菌 ITS rDNA 序列的 PCR 擴(kuò)增Fig.2 PCR products of ITS rDNA fragment from B.bassiana.

2.3 球孢白僵菌對(duì)竹卵圓蝽若蟲(chóng)的室內(nèi)毒力測(cè)定

本研究使用4 株球孢白僵菌的2 種不同濃度的分生孢子懸浮液進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定。研究表明：被球孢白僵菌侵染的竹卵圓蝽若蟲(chóng)的活動(dòng)性降低，取食減少，并逐漸死亡。蟲(chóng)體死亡后，首先在足部以及軀干的體節(jié)處長(zhǎng)出白色的菌絲，后期整個(gè)蟲(chóng)體被球孢白僵菌包裹。通過(guò)連續(xù)13 d 觀察和記錄累計(jì)死亡率，所有4 個(gè)菌株對(duì)竹卵圓蝽若蟲(chóng)都具有很高的致病性。從校正累計(jì)死亡率曲線圖上看出：最初的1～4 d，4 個(gè)菌株對(duì)竹卵圓蝽若蟲(chóng)的致病力均較低，從第5 天開(kāi)始校正累計(jì)死亡率迅速上升，LYC11 菌株在第11 天時(shí)，校正累計(jì)死亡率達(dá)到100.00%，而LYC10 和LYC15 菌株均在第12 天時(shí)，校正累計(jì)死亡率達(dá)到100.00%（圖3）。研究還發(fā)現(xiàn)，LYC10、LYC11 和LYC15 菌株的分生孢子濃度為108孢子·mL-1時(shí)，其校正累計(jì)死亡率高于分生孢子濃度為107孢子·mL-1的值。

圖3 竹卵圓蝽若蟲(chóng)接種不同濃度球孢白僵菌后的逐日校正累計(jì)死亡率Fig.3 Corrected cumulative mortality of H.dorsalis over time after inoculation with various

采用SPSS24.0 進(jìn)行線性回歸分析，獲取回歸方程和決定系數(shù)，依據(jù)回歸方程計(jì)算LT50。所有處理的決定系數(shù)R2都在0.800 以上，死亡率和時(shí)間之間存在顯著的線性關(guān)系（表1）。4 個(gè)菌株對(duì)竹卵圓蝽若蟲(chóng)的致死中時(shí)間LT50在5.04～14.03 之間。當(dāng)分生孢子濃度為108孢子·mL-1時(shí)，LYC10、LYC11、LYC15 和LYC4 菌株的致死中時(shí)間LT50分別為5.04、5.45、6.17 和14.03 d（表1）。

表1 球孢白僵菌菌株對(duì)竹卵圓蝽若蟲(chóng)的致病性和LT50Table 1 Pathogenicity and LT50 of the tested B.bassiana strains against H.dorsalis larvae

校正累計(jì)死亡率越高，毒力越強(qiáng)；致死中時(shí)間LT50越小，毒力越強(qiáng)。綜合以上研究結(jié)果，確定4 株菌株對(duì)竹卵圓蝽若蟲(chóng)的毒力從高到低依次為：LYC10＞LYC11＞LYC15＞LYC4。

2.4 林間生物測(cè)定

林間生物測(cè)定表明：LYC11 菌株對(duì)竹卵圓蝽若蟲(chóng)具有很高的防治效果，隨著分生孢子濃度升高，累計(jì)死亡率快速升高。在接菌后第18 天，5×107、1×107、1×106、1×105、1×104孢子·mL-15 個(gè)濃度的分生孢子的累計(jì)死亡率分別為79.80%、78.89%、77.99%、54.12%、57.14%。

Probit 回歸分析表明：LYC11 菌株的累計(jì)死亡率與分生孢子濃度之間的回歸方程為y=0.234x-1.025；Pearson 擬合優(yōu)度檢驗(yàn)結(jié)果為Χ2=3.745，P=0.290＞0.050，差異不顯著，模型擬合良好。依據(jù)置信限度表得出LYC11 菌株對(duì)竹卵圓蝽若蟲(chóng)的致死中濃度LC50為2.43 × 104孢子·mL-1。

3 討論

昆蟲(chóng)病原真菌是一類(lèi)廣泛存在于自然界的昆蟲(chóng)種群抑制因子，能夠引起昆蟲(chóng)疾病的流行，且具有較高的選擇性、害蟲(chóng)對(duì)其抗性發(fā)展較慢、可通過(guò)寄主傳遞和擴(kuò)散等優(yōu)良特性，而廣泛用于害蟲(chóng)的生物防治[17-19]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約100 屬700 多種昆蟲(chóng)病原真菌，這些真菌中的絕大多數(shù)屬于子囊菌門(mén)（Ascomycota）和 蟲(chóng)霉門(mén)（Entomophthoromycota）[19-20]。球孢白僵菌屬于子囊菌門(mén)真菌，也是一種兼性營(yíng)養(yǎng)的昆蟲(chóng)病原真菌，廣泛存在于溫帶和熱帶地區(qū)的受感染昆蟲(chóng)蟲(chóng)體內(nèi)[12,21]。本研究從毛竹林的竹卵圓蝽僵蟲(chóng)上分離到7 株病原真菌，經(jīng)PDA 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)和形態(tài)特征觀察，分離的菌株與Zimmermann 描述的球孢白僵菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征一致[12]。提取分離菌株的總DNA，采用DNA 條形碼法進(jìn)行物種鑒定，7 個(gè)菌株均被鑒定為球孢白僵菌。

盡管球孢白僵菌能夠侵染15 個(gè)目的700 多種昆蟲(chóng)，然而球孢白僵菌種內(nèi)存在廣泛的自然變異，不同菌株的寄主范圍和毒力存在差異，針對(duì)靶標(biāo)昆蟲(chóng)而篩選出具有更強(qiáng)毒力的菌株，是利用球孢白僵菌進(jìn)行生物防治的關(guān)鍵[12,22-23]。本研究采用室內(nèi)生物測(cè)定法比較了4 株球孢白僵菌的毒力，4 個(gè)菌株的致死中時(shí)間LT50為5.04～14.03 d，LYC10 和LYC11 菌株的毒力最強(qiáng)。

林間應(yīng)用白僵菌進(jìn)行生物防治時(shí)，其殺蟲(chóng)效果和持久性受到陽(yáng)光、雨水、溫度、濕度、林木表面化學(xué)物質(zhì)和微生物群落等生態(tài)因子的影響[24-25]，室內(nèi)篩選出的高毒力的菌株還需要進(jìn)行林間防治效果測(cè)定。因LYC11 菌株的產(chǎn)孢能力強(qiáng)于LYC10 菌株，且LYC10 菌株和LYC11 菌株對(duì)竹卵圓蝽若蟲(chóng)的致死中時(shí)間LT50差異小，故本研究采用LYC11菌株進(jìn)行林間防治效果測(cè)定。結(jié)果表明，LYC11菌株在林間施用時(shí)對(duì)竹卵圓蝽若蟲(chóng)也具有很高的致病能力，但該菌株所有5 個(gè)濃度分生孢子的累計(jì)死亡率均低于室內(nèi)測(cè)定時(shí)第13 天的結(jié)果，這可能是由毛竹林的生態(tài)因子造成的不利影響。進(jìn)一步研究需要明確毛竹林影響球孢白僵菌殺蟲(chóng)效果和持久性的關(guān)鍵生態(tài)因子，針對(duì)這些關(guān)鍵生態(tài)因子，優(yōu)化菌劑的配方和類(lèi)型、施用菌劑的方式和時(shí)間點(diǎn)，減小生態(tài)因子的影響，進(jìn)而獲得最好的殺蟲(chóng)效果。

4 結(jié)論

本研究從竹卵圓蝽僵蟲(chóng)體內(nèi)獲得7 株球孢白僵菌。室內(nèi)生物測(cè)定表明，LYC10、LYC11、LYC15和LYC4 菌株對(duì)竹卵圓蝽若蟲(chóng)均具有很高的毒力，LYC10 菌株的毒力最強(qiáng)；當(dāng)分生孢子濃度為108孢子·mL-1時(shí)，4 個(gè)菌株的致死中時(shí)間LT50分別為5.04、5.45、6.17、14.03 d。林間生物測(cè)定表明，LYC11 菌株的回歸方程為y=0.234x-1.025，LYC11菌株對(duì)竹卵圓蝽若蟲(chóng)的致死中濃度LC50為2.43 ×104孢子·mL-1；接菌后第18 天，LYC11 菌株所有5 個(gè)濃度分生孢子的累計(jì)死亡率均低于室內(nèi)測(cè)定時(shí)第13 天的結(jié)果。