潛態(tài)相關(guān)多肽蛋白在結(jié)直腸腺瘤癌變中的作用研究*

蔡文聘，房太勇

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，福建 泉州 362000

結(jié)直腸癌（CRC）是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居全球惡性腫瘤的第三位，死亡率則位居第四位［1］。據(jù)2018年我國最新癌癥報(bào)告顯示，其發(fā)病率及死亡率在惡性腫瘤中均位居前五位且保持上升趨勢(shì)［2］。CRC的發(fā)生途徑大致分為腺瘤—腺癌途徑（含鋸齒狀腺瘤引起的鋸齒狀途徑）、炎癥—異型增生—癌途徑及de novo途徑，其中以腺瘤—腺癌途徑為主。潛態(tài)相關(guān)多肽（LAP）是一種與TGF-氨基末端非共價(jià)結(jié)合的前肽，兩者結(jié)合后產(chǎn)生的TGF-β復(fù)合體的解離可激活TGF-β的生物活性從而發(fā)揮作用。報(bào)道指出，LAP+CD4+T細(xì)胞是一種新的抑制性細(xì)胞亞群，可通過IL-10和TGF-β介導(dǎo)其免疫抑制作用進(jìn)而促使腫瘤發(fā)生免疫逃逸［3］，其中就包括CRC。然而關(guān)于LAP與結(jié)直腸腺瘤（CRA）的研究則相對(duì)較少，本研究旨在通過檢測(cè)LAP蛋白在不同狀態(tài)下的CRC及CRA中的表達(dá)情況，同時(shí)分析上述各者間的關(guān)系，從而進(jìn)一步研究LAP蛋白在CRA癌變過程中所起的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年9月—2017年6月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院診治的研究對(duì)象的腸組織標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)常規(guī)H&E染色并由專業(yè)病理科醫(yī)師做出病理診斷，其中結(jié)直腸腺癌患者排除術(shù)前接受化療、放療或免疫治療，且三組研究對(duì)象均排除既往腫瘤疾病史、自身免疫性疾病（包括炎癥性腸?。┘案腥拘约膊∈贰Ｑ芯繉?duì)象的臨床資料具體如下。（1）健康體檢者組25例：男12例，女13例，平均年齡（44±10）歲。（2）結(jié)直腸腺瘤組25例：男16例，女9例，平均年齡（56±10）歲；其中直腸腺瘤5例，結(jié)腸腺瘤20例；伴有高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變11例，伴有低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變14例。（3）結(jié)直腸腺癌組33例：男19例，女14例，平均年齡（61±12）歲；其中直腸腺癌14例，結(jié)腸腺癌19例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例；浸潤深度T1～T4分別為5例、5例、10例、13例（參照AJCC／UICC的結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)）。本研究所有受試者均知情同意，研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批后同意執(zhí)行。

1.2 方法

每個(gè)組織標(biāo)本離體后分成兩部分，一部分放入10%福爾馬林固定，行常規(guī)H&E染色并由專業(yè)病理科醫(yī)師進(jìn)行病理診斷，對(duì)應(yīng)的另一部分迅速置入-196℃液氮速凍，后轉(zhuǎn)送入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。檢測(cè)開始前將組織樣品用干凈的剪刀盡量剪碎，后經(jīng)過含有PMSF的RIPA裂解液裂解、離心等步驟提取組織蛋白，并采用BCA試劑盒檢測(cè)提取的蛋白濃度。測(cè)定后將剩余蛋白提取液進(jìn)行SDS-PAGE電泳（90 V 30 min，下層分離膠120 V 60 min）。采用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（100 V 60～90 min）。使用5%脫脂奶粉封閉后依次與一抗（鼠抗人Foxp3單克隆抗體1∶500稀釋；鼠抗人LAP單克隆抗體1∶2 000稀釋）、二抗（羊抗鼠單克隆IgG抗體1∶5 000稀釋）反應(yīng)，在避光條件進(jìn)行曝光、采圖，以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照,最后分析LAP蛋白的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），等級(jí)指標(biāo)采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康體檢、結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸腺癌三者組織中LAP蛋白的表達(dá)情況

運(yùn)用Western-Blot印跡法檢測(cè)各組織中LAP蛋白的表達(dá)情況，見圖1。運(yùn)用單因素方差分析對(duì)三組間LAP蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

圖1 Western-Blot印跡法檢測(cè)三者的LAP蛋白水平（部分結(jié)果）

表1 LAP蛋白在三組中的表達(dá)水平（±s）

表1 LAP蛋白在三組中的表達(dá)水平（±s）

a表示與健康體檢者組及結(jié)直腸腺癌組比較，P＜0.001；b表示與健康體檢者組比較，P＜0.05。

組別健康體檢者組（n=25）結(jié)直腸腺瘤組（n=25）結(jié)直腸腺癌組（n=33）LAP 0.245±0.188 0.861±0.276a 1.157±0.575b

2.2 結(jié)直腸腺瘤組織中LAP蛋白的表達(dá)水平與上皮內(nèi)瘤變級(jí)別的關(guān)系分析

運(yùn)用Spearman相關(guān)系數(shù)分析LAP蛋白的表達(dá)水平與腺瘤上皮內(nèi)瘤變級(jí)別之間的關(guān)系，可見LAP蛋白的表達(dá)水平與腺瘤上皮內(nèi)瘤變的級(jí)別呈正相關(guān)（rs=0.849），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）見表2。

表2 結(jié)直腸腺瘤組LAP蛋白表達(dá)水平與上皮內(nèi)瘤變級(jí)別關(guān)系（±s）

表2 結(jié)直腸腺瘤組LAP蛋白表達(dá)水平與上皮內(nèi)瘤變級(jí)別關(guān)系（±s）

上皮內(nèi)瘤變級(jí)別低級(jí)別（n=14）高級(jí)別（n=11）LAP 0.949±0.687 1.136±0.161

2.3 結(jié)直腸腺癌組織中LAP蛋白的表達(dá)水平與臨床病理的關(guān)系分析

運(yùn)用獨(dú)立t檢驗(yàn)分析LAP蛋白的表達(dá)水平與腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，可見LAP蛋白的表達(dá)水平與腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。運(yùn)用Spearman相關(guān)系數(shù)分析LAP蛋白的表達(dá)水平與腺癌浸潤深度的關(guān)系，可見LAP蛋白的表達(dá)水平與腺癌浸潤深度呈正相關(guān)（rs=0.543），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），見表4。

表3 結(jié)直腸腺癌組LAP蛋白表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系（±s）

表3 結(jié)直腸腺癌組LAP蛋白表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系（±s）

a表示與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，P＜0.05。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有（n=19）無（n=14）LAP 1.458±0.681a 0.961±0.403

表4 結(jié)直腸腺癌組LAP蛋白表達(dá)水平與腺癌浸潤深度關(guān)系（±s）

表4 結(jié)直腸腺癌組LAP蛋白表達(dá)水平與腺癌浸潤深度關(guān)系（±s）

浸潤深度T1（n=5）T2（n=5）T3（n=10）T4（n=13）LAP 0.712±0.314 0.758±0.156 1.218±0.475 1.434±0.662

3 討論

CRC是常見的消化道惡性腫瘤，在疾病晚期可明顯縮短患者生存期，同時(shí)可引起一系列并發(fā)癥（如消化道出血、穿孔、梗阻等），進(jìn)而增加患者痛苦、降低患者生活質(zhì)量，給家庭乃至國家?guī)斫?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。要解決上述難題，重點(diǎn)及難點(diǎn)就在于如何實(shí)現(xiàn)對(duì)CRC的早診早治。

在CRC的早期診斷方面，目前關(guān)于CRC早期診斷的指標(biāo)多種多樣，既往常見的糞便隱血試驗(yàn)和血清CEA及CA199等指標(biāo)因特異度和靈敏度較低均限制了其價(jià)值。隨著分子生物學(xué)及高通量檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展，包括相關(guān)核酸標(biāo)志物及蛋白標(biāo)志物等在內(nèi)的新型診斷指標(biāo)不斷涌現(xiàn)，其中，在相關(guān)核酸標(biāo)志物方面，循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）［4］、環(huán)狀RNA（circRNA）［5］、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）HNF1A-AS1［6］及微小RNA1229（miR-1229）［7］等均已被證實(shí)可以作為CRC早期診斷的潛在標(biāo)志物。而在相關(guān)蛋白標(biāo)志物方面，自身抗體，包括抗P53蛋白自身抗體（Ap53Ab）［8］、CEA-IgM［9］、抗黏蛋白（MUC）自身抗體，抗凋亡抑制（IAP）蛋白自身抗體等，基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMP3）、血小板反應(yīng)蛋白（THPS2）、膠原蛋白家族的COL10A1等［7］亦被證實(shí)可以作為CRC早期診斷的潛在標(biāo)志物。然而上述生物標(biāo)志物的作用更多的體現(xiàn)在CRC的發(fā)展及預(yù)后方面，且檢測(cè)費(fèi)用昂貴，不適用于臨床普及推廣。研究表明［10］，從腺瘤到腺癌這個(gè)演變過程通常需要10～15年的時(shí)間，然而并非所有CRA都會(huì)發(fā)生癌變，也并非所有CRA都要經(jīng)過10年以上歷程才會(huì)演變?yōu)橄侔虼藢?duì)于高危CRA的識(shí)別顯得尤為重要。目前關(guān)于CRA發(fā)生癌變的始動(dòng)因素及促進(jìn)因素的研究仍寥寥無幾。吳義娟等［11］研究表明，腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（MTA1）、逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)的富含半胱氨酸、含有kazal域的蛋白（RECK）在結(jié)腸腺瘤的癌變過程中起重要作用，而王少軍等［12］研究表明，Decorin蛋白在高危CRA中的表達(dá)下降，可用于結(jié)腸腺瘤惡性程度的評(píng)價(jià)。本研究中CRA組織中的LAP蛋白水平高于健康體檢者而低于CRC患者，同時(shí)與上皮內(nèi)瘤變的級(jí)別呈正相關(guān)，這提示LAP蛋白很有可能參與了CRA癌變的發(fā)生及發(fā)展，可作為高危CRA的識(shí)別因素之一。

在CRC的早期治療方面，目前消化內(nèi)鏡下治療技術(shù)（如ESD）已日趨成熟，逐漸成為早期CRC的主流干預(yù)措施。國內(nèi)多個(gè)指南及共識(shí)［13-14］均指出存在下列情況者：（1）基底切緣陽性。（2）組織學(xué)呈分化差的癌（低分化腺癌、未分化癌、印戒細(xì)胞癌、黏液腺癌等）。（3）黏膜下浸潤深度≥1 000μm。（4）脈管侵犯陽性。（5）腫瘤出芽G2/G3，被視為早期CRC內(nèi)鏡下非治愈性切除，需進(jìn)一步追加外科手術(shù)。然而近幾年國內(nèi)外出現(xiàn)越來越多關(guān)于早期CRC內(nèi)鏡下非治愈性切除術(shù)后追加外科手術(shù)結(jié)果陰性的病例報(bào)道。孫躍明等［15］研究結(jié)果提示，早期CRC內(nèi)鏡下非治愈性切除術(shù)后追加外科手術(shù)的患者中有90.2%呈現(xiàn)陰性結(jié)果。王瑞剛等［16］研究均支持黏膜下浸潤深度≥2 000 μm是早期CRC內(nèi)鏡下非治愈性切除術(shù)后預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。早期CRC內(nèi)鏡下非治愈性切除術(shù)后追加外科手術(shù)的指征里面將浸潤深度限定在1 000μm以內(nèi)，根本原因還在于對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)擔(dān)憂。本研究結(jié)果提示，LAP蛋白的表達(dá)水平與腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度呈正相關(guān)，若將LAP蛋白的表達(dá)與上述標(biāo)準(zhǔn)綜合考慮，可進(jìn)一步減少早期CRC內(nèi)鏡下非治愈性切除術(shù)后追加不必要外科手術(shù)的可能。

在進(jìn)展期CRC的診治方面，目前主要是采取包括手術(shù)及化療在內(nèi)的綜合治療，但是創(chuàng)傷較大且部分效果欠佳，同時(shí)存在無法耐受手術(shù)及化療的情況，這迫使我們需要尋求一種新的治療手段。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）是目前發(fā)現(xiàn)的一種具有免疫抑制功能的重要細(xì)胞亞群，被證實(shí)在多種惡性腫瘤（包括CRC）組織內(nèi)浸潤，可促使腫瘤發(fā)生免疫逃逸，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，LAP+CD4+T細(xì)胞就是其中的一種Tregs。MAHALINGAM等［17］從CRC患者的外周血中分離出LAP+CD4+T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)外周血中的LAP+CD4+T細(xì)胞同樣具有免疫無能性及免疫抑制性。鐘武等［18］研究顯示，LAP+CD4+T細(xì)胞的分布依次為CRC腫瘤組織、CRC外周血、相應(yīng)癌旁組織及健康志愿者外周血，提示LAP+CD4+T細(xì)胞易聚集于CRC腫瘤組織中，可能參與了CRC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)一致，因此LAP相關(guān)免疫制品將為進(jìn)展期CRC的治療提供新選擇。

綜上所述，LAP蛋白對(duì)CRA癌變的發(fā)生及發(fā)展起到促進(jìn)作用，同時(shí)有望成為制定早期CRC內(nèi)鏡下非治愈性切除術(shù)后進(jìn)一步干預(yù)標(biāo)準(zhǔn)的參考指標(biāo)之一。當(dāng)然，本研究尚存在些不足，比如樣本量較小，T1癌中未進(jìn)一步細(xì)化SM1期癌、SM2期癌等與LAP蛋白的表達(dá)水平的相關(guān)性等，期待在日后的研究工作中可得到進(jìn)一步的證實(shí)。