油茶轉(zhuǎn)錄因子基因CoSOC1-like 的克隆和表達(dá)分析

黃國(guó)文，管天球，趙雨云，陳莫林，劉宏輝

(湖南科技學(xué)院化生院，湖南 永州 425199)

油茶（Camellia oleiferaAbel.）為山茶科山茶屬常綠灌木或小喬木，是一種重要的木本油料樹種[1]，主要分布在我國(guó)長(zhǎng)江流域及以南地區(qū)的湖南、安徽、廣東、廣西、福建等省區(qū)。茶油含有90%以上不飽和脂肪酸，具有降血脂、預(yù)防心腦血管疾病等功效，是有利于人類健康的食用油。油茶是蟲媒、兩性花的異花授粉植物。油茶的成花時(shí)間長(zhǎng)。“湘林1 號(hào)”油茶（Camellia oleifera‘Xianglin1）’的花芽分化從5 月下旬開始到9 月上旬結(jié)束，經(jīng)過生理分化期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期、子房和花藥形成期、雌雄蕊成熟期等階段[2]，然而，“長(zhǎng)林4 號(hào)”油茶（Camellia oleifera‘Changlin4）’花芽分化的開始時(shí)間是6 月上旬[3]，10月中下旬開花結(jié)果。植物成花受光周期途經(jīng)、自主春化途徑、赤霉素途徑和糖類途經(jīng)等的基因調(diào)節(jié)，也受開花整合子SOC1、FT、LFY等基因的調(diào)節(jié)，最后受同源異形基因AP1、SEP、AG等的調(diào)控完成花器官發(fā)育[4-5]。SOC1基因是MADSbox 家族基因之一。MADS-box 基因家族在調(diào)節(jié)植物的花器官發(fā)育、開花時(shí)間、胚珠發(fā)育、根瘤形成和對(duì)環(huán)境信號(hào)反應(yīng)等方面起作用[6-7]。在真核生物中，MADS-box 基因家族是一類編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因組成，其蛋白質(zhì)具有高度保守的MADS 結(jié)構(gòu)域[8]，能夠使本身蛋白質(zhì)以二聚體的形式結(jié)合其它輔助因子和DNA，調(diào)節(jié)基因的時(shí)空表達(dá)。在被子植物中，大多數(shù)SOC1基因含有 7 個(gè)外顯子和6 個(gè)內(nèi)含子，其編碼的蛋白除了含有保守的MADS-box 以外,還含有K-box 和非保守的I 區(qū)、C 區(qū)，因此，屬于MIKC 型[9]。K-box 是一個(gè)半保守片段，主要由有3 個(gè)α 螺旋組成，其中，前面2 個(gè)螺旋和第3 個(gè)螺旋的作用分別是決定本身蛋白二聚化的特異性和形成高級(jí)復(fù)合物，是蛋白質(zhì)相互作用部位[10]；I 區(qū)的序列變化較大，主要促進(jìn)蛋白二聚體本身與DNA 的結(jié)合；C 區(qū)由疏水性氨基酸組成的最不保守區(qū)域，是基因轉(zhuǎn)錄的激活區(qū)，但有些SOC1 蛋白也具有一個(gè)保守的MOTIF結(jié)構(gòu)域，因此，被劃入SOC1/TM3 亞家族[11]，SOC1的不同功能主要由不同的C 區(qū)基序完成[12]。目前，在大豆（Glycine max(Linn.) Merr.）[13-14]、玉米（Zea maysL.）[15]、煙草（Nicotiana tabacumL.）[16]、芒果（Mangifera indicaL.）[17]、油菜（Brassica campestrisL.）[18]、擬南芥(Arabidopsis thaliana（L.）Heynh)[19-20]、茶樹(Camellia sinensis(L.) O.Ktze)[21-22]、橘子(Citrus reticulataBlanco)[23]、火龍果 (Hylocereus polyrhizus(Haw) Britt &Ros)[24]、牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）[25]等植物中的SOC1基因序列和作用都有報(bào)道，但關(guān)于油茶中SOC1同源基因的序列和作用的報(bào)道很少。本研究采用RT-PCR 技術(shù)和RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技術(shù)克隆油茶的CoSOC1-like基因，用生物信息學(xué)方法研究其序列特征，用熒光定量PCR 技術(shù)研究CoSOC1-like基因的表達(dá)模式，用基因瞬時(shí)表達(dá)法研究蛋白的亞細(xì)胞定位，為進(jìn)一步研究油茶CoSOC1-like基因的功能打下基礎(chǔ)，為揭示油茶成花的分子機(jī)制和花期調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

油茶材料采摘于湖南科技學(xué)院油茶示范基地的3 年生油茶‘湘林210（’Camellia oleifera‘Xianglin 210）’品種。采摘后的葉片立即放于干冰盒中冷凍保存運(yùn)輸，后轉(zhuǎn)存入-70 ℃超低溫冰箱，在48 h內(nèi)提取RNA。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油茶CoSOC1-like基因的克隆 采用RACE方法克隆油茶CoSOC1-like基因[26]。以油茶幼嫩葉片為材料，用RNA 提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取葉片總RNA。使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定RNA 的質(zhì)量。以RNA 完整且無蛋白質(zhì)污染的RNA 作為底物，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）合成cDNA 第一鏈。擴(kuò)增CoSOC1-like基因的引物序列見表1。以cDNA第一鏈為模板，F(xiàn)1 和R1、F2 和R2 為引物和高保真的PFU 酶（北京全式金生物技術(shù)有限公司）構(gòu)建反應(yīng)體系，進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增，獲得基因的核心片段。使用3′和5′RACE cDNA 擴(kuò)增試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）提供的引物、F3 和R3、F4 和R4 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得基因的3′端序列片段和5′端序列片段。每個(gè)片段經(jīng)過瓊脂糖凝膠回收試劑盒（上海生物工程股份有限公司）回收，與pGM-T 載體（北京索萊寶公司）連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 細(xì)胞，并涂布在含有100 μg·mL-1氨芐青霉素的固體LB 培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，37 ℃培養(yǎng)16 h。用PCR 法鑒定白色菌落的陽性克隆。用質(zhì)粒提取試劑盒（上海生物工程股份有限公司）提取5～10 個(gè)陽性克隆的質(zhì)粒，送至北京擎科生物科技有限公司湖南分公司測(cè)序。將每個(gè)序列在DNAMAN 軟件中拼接，獲得含有全長(zhǎng)CoSOC1-like基因序列的片段。

表1 CoSOC1-like 基因的引物序列Table 1 Primer sequences of CoSOC1-like

1.2.2 油茶CoSOC1-like基因序列的生物信息學(xué)分析 用DNAStar 5.0 軟件分析油茶CoSOC1-like基因開放閱讀框，并推導(dǎo)氨基酸序列。用DNAMAN 軟件預(yù)測(cè)油茶CoSOC1-like 蛋白質(zhì)序列的疏水性、親水性和跨膜結(jié)構(gòu)域。采用SOPMA在線工具（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/）分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；用Phyre2 在線工具分析蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)；在PSORT 在線工具（http://psort.hgc.jp/）上進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；運(yùn)用在線KinasePhos 2.0 軟件對(duì)CoSOC1-like 蛋白作用方式預(yù)測(cè)；利用MEGA5.0軟件的Clustal W 法進(jìn)行比對(duì)，用鄰接法構(gòu)建同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(自展值Bootstrap 設(shè)定為1 000,其它參數(shù)的缺省值不變)。

1.2.3 油茶CoSOC1-like基因表達(dá)模式分析 在2020 年12 月20 日取處于開花后期油茶的根、幼莖、葉片、營(yíng)養(yǎng)芽、花瓣、雄蕊、柄托雌（花柄、花托和雌蕊部分的總稱，因?yàn)榛ū滩⑶一ㄍ泻妥臃烤o密結(jié)合，不易區(qū)分且很難分離）等部分提取總RNA。在2021 年5 月30 日取處于花芽生理分化期油茶的根、幼莖、葉片、頂芽（未出現(xiàn)分化的芽）、營(yíng)養(yǎng)芽、花芽和幼果等部分提取RNA。在2021 年6 月30 日取處于雌蕊和雄蕊形成期油茶的根、莖、葉片、營(yíng)養(yǎng)芽（0.4 cm 左右）、花芽（0.8 cm 左右）、果皮和種子等部分提取RNA。在2021 年7 月30 日取處于花芽子房和花藥形成期（去掉苞片的花芽中有肉眼可見的約2 mm 左右分叉柱頭、1 mm 左右的雄蕊）油茶的根、莖、葉片、營(yíng)養(yǎng)芽（0.5 cm 左右）、花芽（1.3 cm 左右）、果皮和種子等部分提取RNA。所有的RNA 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 后用于熒光定量PCR。測(cè)定基因表達(dá)量的引物為，油茶CoSOC1-like基因引物為F:5′TCTCTGCGATGCTGAGGTTG 3′，R:5′ TCTATCTGCTTTGCCATGTCTG 3′，片段長(zhǎng)度195 bp。ACTIN基因引物為F:5′ TAGACTTGC GGCATCAGTTAGA 3′，R:5′ TTCACGGTTTTT GGACGGATT 3′，片段長(zhǎng)度176 bp。所用儀器為BIO-RAD 的 CFX Connect Real-Time System，試劑是賽默飛世爾科技有限公司的Power SYBR?Green PCR 預(yù)混液（貨號(hào):4367659) 。反應(yīng)體積為 20 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5.0 ℃ 3 min，95.0 ℃15 s，55.0 ℃ 20 s，72.0 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)，72.0 ℃ 5 min，4 ℃保存。每個(gè)樣品設(shè)置 3 次重復(fù)，采用 2-ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，利用 SPSS19 軟件的單變量方差分析的 Duncan 多重比較法進(jìn)行顯著性差異和標(biāo)準(zhǔn)誤分析。

1.2.4 油茶CoSOC1-like 蛋白的亞細(xì)胞定位分析

以擴(kuò)增油茶CoSOC1-like基因全長(zhǎng)的加入XbaI酶切位點(diǎn)的正向引物（F:5′ GCTCTAGAG ATGGTG AGAGGGAAGACTCAGATGA 3′）、加入了XmaI 酶切位點(diǎn)的反向引物（R:5′ TCCCCCCGGGGTAACT TCTGAGGCGAAGCACGCT 3′）和高保真的PFU酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增出基因全長(zhǎng)。對(duì)CoSOC1-like基因全長(zhǎng)和pBI121-EGFP 質(zhì)粒（湖南豐輝生物科技有限公司）分別進(jìn)行XbaI 和XmaI（北京NEB公司）雙酶切，用瓊脂糖凝膠DNA 片段回收試劑盒對(duì)酶切片段進(jìn)行回收，然后用T4 DNA 連接酶（美國(guó)clontech 公司）連接這2 個(gè)片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，用含有抗生素Amp 的LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)菌斑進(jìn)行PCR 鑒定和測(cè)序鑒定獲得陽性克隆。將此陽性克隆用熱激法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105 菌株中。用含有0.1 mol·L-1乙酰丁香酮和25 μg·mL-1利福平的YEB 培養(yǎng)基培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105 到OD600為0.5～0.6 時(shí)，轉(zhuǎn)速5 000 rpm離心10 min 收集農(nóng)桿菌，用重懸液（10 mmol·L-1MES，0.1 mmol·L-1乙酰丁香酮和10 mmol·L-1氯化鎂，過濾除菌）懸浮農(nóng)桿菌，用注射器將農(nóng)桿菌注射到洋蔥(Allium cepaL.)鱗片內(nèi)表皮中，1 d后取洋蔥鱗片內(nèi)表皮在熒光顯微鏡（日本Nikon ECLIPSE Ni-U）下觀察EGFP 蛋白的綠色熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶CoSOC1-like 基因的克隆和序列分析

CoSOC1-like基因的核心片段用PCR 反應(yīng)擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，表明擴(kuò)增產(chǎn)物約在350 bp 左右處有一條亮帶，無其它雜帶（圖1）。用5′RACE 反應(yīng)和3′RACE 反應(yīng)，擴(kuò)增基因的5′端序列和3′末端序列；經(jīng)過測(cè)序和拼接，獲得序列1 025 bp 片段。經(jīng)過開放閱讀框分析，此DNA 片段包含1 個(gè)完整的654 bp CDS 和150 bp 5′UTR、221 bp 3′UTR（圖2）。

圖1 油茶CoSOC1-like 基因片段的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis result of CoSOC1-like fragment of Camellia oleifera from RT-PCR

2.2 油茶CoSOC1-like 蛋白質(zhì)的氨基酸特征和一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

油茶CoSOC1-like基因的CDS 序列編碼217個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)(圖2)。蛋白質(zhì)分子量為24.958 kDa，等電點(diǎn)為6.8。帶負(fù)電荷的氨基酸(Asp+Glu)數(shù)量為37 個(gè)，帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)數(shù)量為36 個(gè)，平均疏水性值為-0.77，平均親水性值為0.361，屬于親水性蛋白。該蛋白無信號(hào)肽位點(diǎn),是非分泌蛋白，也無跨膜螺旋區(qū)。

油茶CoSOC1-like 蛋白質(zhì)與其它物種SOC1蛋白的同源性比對(duì)結(jié)果（圖3）表明：它與茶樹SOC1-like（XP-028068271.1）的同源性為97.7%、與榴蓮（XP_022769695.1）的SOC1-like 同源性為78.4%、與核桃（XP_018851690.1）的SOC1-like 同源性為75.46%、與加州白櫟（XP_030930174.1）的SOC1同源性為79.1%，與獼猴桃（AKH61958.1）SOC1e 同源性為82.16%、與山核桃（AHI85950.1）的SOC1 同源性為75.35%，與楊梅（KAB1200892.1）的SOC1同源性為75.94%，表明所克隆到的片段為油茶SOC1同源基因，本文將該基因命名為CoSOC1-like,并在GenBank 注冊(cè)，登錄號(hào)為MT036382。該序列蛋白質(zhì)CoSOC1-like 結(jié)構(gòu)包含MADS-box（1-74 位的氨基酸）、I-domain（75-83 位的氨基酸）、K-box（84-172 位的氨基酸）、C-domain四種結(jié)構(gòu)域，屬于植物Ⅱ型MADS-box基因的蛋白結(jié)構(gòu)，C-domain 中含有SOC1 MOTIF，因此CoSOC1-like 屬于SOC1/TM3 型。

圖2 CoSOC1-like 基因cDNA 全長(zhǎng)序列和開放閱讀框及其氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of CoSOCl-like

圖3 CoSOC1-like 基因編碼的氨基酸與其它植物的SOC1 的序列比對(duì)Fig.3 Alignments of the CoSOC1 -like deduced amino acid sequences with other SOC1 proteins from plants

2.3 油茶CoSOC1-like 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸主要依賴于氫鍵而建立的有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象，主要包括α-螺旋、β-折疊片、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。油茶CoSOC1-like 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4）表明：油茶CoSOC1-like 蛋白含有α-螺旋56.68%、β-轉(zhuǎn)角4.15%、折疊延伸鏈10.14%和無規(guī)卷曲29.0%。在蛋白質(zhì)的84—172 位K-box 的氨基酸段有3 個(gè)很明顯的α-螺旋，這3 個(gè)α-螺旋是MIKC 型MADSbox 基因的特征序列。在蛋白質(zhì)的C-domain 的氨基酸段主要是卷曲和折疊延伸鏈組成。

圖4 CoSOC1-like 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Secondary structure prediction of CoSOC1-like protein

2.4 油茶CoSOC1-like 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指一條多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)甚至結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上，依靠氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的疏水作用、范德華力及氫鍵和靜電作用，進(jìn)一步盤旋和折疊形成特定空間結(jié)構(gòu)。油茶CoSOC1-like 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖5）表明：CoSOC1-like 屬于SRF-LIKE家族的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)的油茶CoSOC1-like 三級(jí)結(jié)構(gòu)的肽鏈與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果較一致。在CoSOC1-like 蛋白質(zhì)的氨基端有2 個(gè)明顯的α-螺旋（紅色和黃色螺旋部分），屬于蛋白的MADS-box區(qū)域；中間部分有2 個(gè)同向平行的折疊延伸鏈，還有一個(gè)較長(zhǎng)的α-螺旋（青綠色α-螺旋部分）屬于K-box 域；蛋白的羧基端是無規(guī)卷曲（深藍(lán)色部分）。整個(gè)蛋白質(zhì)折疊成了一個(gè)緊密的并且有“空穴”（活性部位）的空間結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)與它結(jié)合DNA 和激活基因轉(zhuǎn)錄功能相適應(yīng)。

圖5 CoSOC1-like 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Tertiary structure prediction of CoSOC1-like protein

2.5 油茶CoSOC1-like 蛋白的亞細(xì)胞定位和磷酸化位點(diǎn)分析

預(yù)測(cè)油茶CoSOC1-like 蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位表明：油茶CoSOC1-like 蛋白沒有信號(hào)肽存在，不是外分泌蛋白；在蛋白質(zhì)153 位上存在亮氨酸拉鏈模式（LKEKEKVLTAENAKLCEKYGLL），3 位上存在SRF 型轉(zhuǎn)錄因子DNA 結(jié)合和二聚化結(jié)構(gòu)域(RGKTQMRRIENATSRQVTFSKRRNGLLKKAFE LSVLCDAEVALIIFSPRGKLYEF)，CoSOC1-like位于細(xì)胞核的可能性最大，其次為線粒體中(表2)。

表2 CoSOC1-like 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析結(jié)果Table 2 Subcellular localization prediction of CoSOC1-like protein

將CoSOC1-like基因與載體pBI121-EGFP 融合，構(gòu)建的pBI121-CoSOC1-like-EGFP 融合載體轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，以轉(zhuǎn)化空載體的洋蔥表皮細(xì)胞作為對(duì)照，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照中整個(gè)洋蔥表皮細(xì)胞（包括細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核）都發(fā)出綠色熒光（圖6 a、c），說明該空載體是有作用的；融合載體轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞中只有細(xì)胞核中發(fā)出綠色熒光（圖6 d、f），說明CoSOC1-like 蛋白不是定位于線粒體，而是定位于細(xì)胞核中。

圖6 熒光顯微鏡（200X）下觀察CoSOC1-like 蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位Fig.6 Localization of CoSOC1-like protein in oinion epidermal cells observed in a fluorescence microscope（200X）

對(duì)CoSOC1-like 蛋白序列修飾位點(diǎn)分析表明：CoSOC1-like 蛋白含有17 個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、10 個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)、4 個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，說明該蛋白活性受磷酸化作用。油茶CoSOC1-like 轉(zhuǎn)錄因子可能是通過蛋白質(zhì)磷酸化激活，與有關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)相互作用達(dá)到調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的目的。

2.6 油茶CoSOC1-like 蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)油茶CoSOC1-like 蛋白與茶樹、地花（Monotropa hypopitysLinn.）、獼猴桃、小果咖啡（Coffea arabicaL.）、雞血藤（Spatholobus suberectusDunn）、大豆、加州白櫟、栓皮櫟（Quercus suberL.）、楊梅、山核桃、核桃、擬南芥、麻瘋樹(Jatropha curcasL.)、煙草、河岸葡 萄 (Vitis ripariaMchx.)、蓖 麻 (Ricinus communisL.)、小 麥(Triticum aestivumL.)、水稻 (Oryza sativa‘ Japonica Group’)、高 粱(Sorghum bicolorL.)、玉米等植物SOC1 及其同源蛋白，在氨基酸水平構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果(圖7)表明：以小麥、水稻、高粱、玉米等單子葉植物SOC1 及其同源蛋白作為外群，可以將比較的其他植物SOC1 及其同源蛋白分為2 個(gè)分化類群。第1 個(gè)類群中包含油茶CoSOC1-like、茶樹2 個(gè)SOC1-like、地花SOC1、獼猴桃的SOC1e和SOC1i、小果咖啡SOC1-like、雞血藤SOC1、大豆的SOC1、加州白櫟SOC1、栓皮櫟SOC1 isoform X1、楊梅SOC1、山核桃的SOC1、核桃SOC1-like、擬南芥SOC1、麻瘋樹SOC1 isoform X1，自展支持率為100%；油茶CoSOC1-like 與茶樹2 個(gè)CsSOC1-like 聚類在同一個(gè)進(jìn)化支上，自展支持率為100%。第2 個(gè)類群包括茶樹SOC1-like isoform X1 和X2、煙草SOC1-like、河岸葡萄SOC1、蓖麻的SOC1，自展支持率為100%。說明油茶的CoSOC1-like 與茶樹SOC1-like 的親緣關(guān)系最近，與獼猴桃SOC1e 和SOC1i、地花SOC1 的親緣關(guān)系較近，與小果咖啡SOC1-like、雞血藤SOC1、大豆的SOC1、加州白櫟SOC1等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與茶樹的SOC1-like isoform X1 和X2、煙草SOC1-like、河岸葡萄和蓖麻的SOC1 的親緣關(guān)系更遠(yuǎn)。這說明油茶CoSOC1-like具有較高種屬特性，可為今后研究油茶CoSOC1-like基因的功能提供相應(yīng)的參考。

圖7 油茶CoSOC1-like 與其他物種SOC1 同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.7 Phylogenetic evolutionary tree analysis of CoSOCl-like and homologous SOC1 proteins form other plants

2.7 油茶CoSOC1-like 基因的表達(dá)分析

為了理解油茶CoSOC1-like基因的表達(dá)情況，分析了不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的油茶各個(gè)器官的基因表達(dá)量。對(duì)處于開花后期油茶植株的根、莖、葉、營(yíng)養(yǎng)芽、花瓣、雄蕊、柄托雌（花柄、花托和雌蕊部分）等部位進(jìn)行了熒光定量RT-PCR 分析，結(jié)果（圖8）表明：CoSOC1-like基因在所檢測(cè)的各個(gè)部位都有表達(dá)，其中，在根和莖中表達(dá)水平相對(duì)較高，在葉片、營(yíng)養(yǎng)芽、花瓣、雄蕊和柄托雌等部位表達(dá)水平相當(dāng)。對(duì)處于花芽生理分化期油茶的各個(gè)器官的熒光定量RT-PCR 分析結(jié)果（圖9）表明：CoSOC1-like基因在花芽中的相對(duì)表達(dá)量最多，在根、莖、葉、頂芽、營(yíng)養(yǎng)芽、幼果中都有一定的相對(duì)表達(dá)量且表達(dá)量相當(dāng)。對(duì)處于雌蕊和雄蕊形成期油茶的各個(gè)器官的熒光定量RTPCR 分析結(jié)果（圖10 A）表明：CoSOC1-like基因在花芽中的相對(duì)表達(dá)量最多，在根、莖、葉、營(yíng)養(yǎng)芽、果皮和種子中的相對(duì)表達(dá)量差別不大。對(duì)花芽處于子房和花藥形成期油茶的各個(gè)器官的熒光定量RT-PCR 分析結(jié)果（圖10 B）表明：CoSOC1-like基因在花芽中的相對(duì)表達(dá)量最多，在根、莖和葉中的相對(duì)表達(dá)量較多，在營(yíng)養(yǎng)芽、果皮和種子中的相對(duì)表達(dá)量較少，并且在營(yíng)養(yǎng)芽、果皮和種子中有一定的絕對(duì)表達(dá)量。這些結(jié)果說明，CoSOC1-like基因不僅可以調(diào)節(jié)生理分化期、雌蕊和雄蕊形成期、子房和花藥形成期的花芽生長(zhǎng)分化，也可以調(diào)節(jié)根、莖、葉、營(yíng)養(yǎng)芽、果皮和種子的生長(zhǎng)發(fā)育。

圖8 油茶開花后期的CoSOC1-like 基因在不同部位的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression level of CoSOC1-like gene of different parts of Camellia oleifera in the late flower stage

圖9 油茶花芽生理分化期的CoSOC1-like 基因在不同部位的相對(duì)表達(dá)量Fig.9 Relative expression level of CoSOC1-like gene of different parts of Camellia oleifera in the stage of physiological differentiation of flower bud

圖10 油茶花芽不同分化期的CoSOC1-like 基因在不同部位的相對(duì)表達(dá)量Fig.10 Relative expression level of CoSOC1-like gene of different parts of Camellia oleifera in the stages of different differentiation of flower bud

3 討論

植物從幼年期生長(zhǎng)到成熟期以后，就進(jìn)入成花階段。這個(gè)階段包括植物感受開花信號(hào)的刺激，誘導(dǎo)植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化的成花誘導(dǎo)階段，花的分生組織分化成花原基和花器官原基的分化階段以及花器官形成和生長(zhǎng)等3 個(gè)階段[27-28]。SOC1基因是開花整合子基因，能夠感受光周期途徑、自主/春化途徑、赤霉素途徑、糖類途徑和溫敏途徑等開花刺激途徑中的信號(hào)，誘導(dǎo)花分生組織特征的表達(dá)和花器官的形成，促進(jìn)植物開花[29-31]。

本試驗(yàn)根據(jù)在很多物種中存在的SOC1同源基因序列，利用RACE 方法，成功地從油茶中克隆出油茶SOC1同源基因cDNA 序列，命名為CoSOC1-like，基因編碼區(qū)654 bp 核苷酸，編碼217 個(gè)氨基酸,GenBank 登陸號(hào)為MT036382。同源蛋白質(zhì)比對(duì)結(jié)果表明，油茶CoSOC1-like 蛋白具有MADS-box 家族基因的typeⅡ型結(jié)構(gòu)，包含MADS-box、I-domain、K-box 和C-domain 4 部分,且在C 結(jié)構(gòu)域含有SOC1MOTIF 結(jié)構(gòu)，屬于SOC1/TM3 型亞家族基因，是一個(gè)MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子[32]。蛋白序列分析表明，油茶的CoSOC1-like 蛋白沒有跨膜螺旋區(qū)，不含信號(hào)肽，含有SRF 型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA 的結(jié)構(gòu)域；基因瞬時(shí)表達(dá)表明CoSOC1-like 蛋白定位于細(xì)胞核，與綠竹SOC1-like[33]和小麥TaSOC1-like 蛋白[34]的定位是一致的，符合轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和亞細(xì)胞定位特征。油茶CoSOC1-like 蛋白有31 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，它的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈特征與它的一級(jí)結(jié)構(gòu)是一致的，該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出的緊密又有活性部位的空間結(jié)構(gòu)，說明CoSOC1-like 蛋白通過磷酸化作用結(jié)合DNA 并激活基因的轉(zhuǎn)錄作用。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，油茶CoSOCl-like 蛋白與茶樹SOC1-like 蛋白聚為一枝，親緣關(guān)系最近，其次與獼猴桃SOC1e 和SOC1i、地花的SOC1的親緣關(guān)系較近，與小果咖啡SOC1-like、雞血藤和大豆以及擬南芥的SOC1 等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與茶樹的SOC1-like isoform X1 和X2、煙草SOC1-like、河岸葡萄和蓖麻的SOC1 的親緣關(guān)系更遠(yuǎn)，說明油茶CoSOC1-like 具有獨(dú)特的序列特征。由于茶樹CsSOC1-like 具有調(diào)節(jié)茶樹開花時(shí)間作用[35]，因此，推測(cè)油茶CoSOCl-like 也能夠調(diào)節(jié)油茶的開花時(shí)間。

植物的SOC1-like基因的功能具有多樣性。苜蓿的SOC1-like基因MtSOC1a不僅可以促進(jìn)開花，還可以促進(jìn)主莖的伸長(zhǎng)[36]；過表達(dá)矮牽牛的SOC1-like基因能夠促進(jìn)煙草的花瓣和葉片的光合作用，并增強(qiáng)煙草對(duì)高溫的耐受性[37]。基因表達(dá)分析結(jié)果表明，CoSOC1-like基因在油茶不同發(fā)育階段的營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中都有表達(dá)，這一個(gè)特點(diǎn)與松樹中SOC1-like基因MADS11的表達(dá)類似[38]。CoSOC1-like基因在花芽生理分化期、雌雄蕊形成期和子房花藥形成期的花芽中的相對(duì)表達(dá)量最多，在根、莖、葉、頂芽、營(yíng)養(yǎng)芽、幼果、種子中都有一定量的相對(duì)表達(dá)量，這個(gè)特點(diǎn)與核桃MADS-like基因在花芽中的相對(duì)表達(dá)量最高相似，但是又不同于核桃的根、莖、葉中相對(duì)表達(dá)量很低的特點(diǎn)[39]；在子房和花藥形成期的果皮和種子中CoSOC1-like的相對(duì)表達(dá)量低，這與梅花PmSOC1-like基因在果實(shí)和種子中相對(duì)表達(dá)量低一致[40]。在開花后期，CoSOC1-like基因在根和莖中相對(duì)表達(dá)量較多，在葉片、營(yíng)養(yǎng)芽、花瓣、雄蕊和柄托雌等部位表達(dá)水平相當(dāng)。說明油茶CoSOC1-like基因除了參與油茶的花芽分化以外，還可能參與油茶的根、莖、葉和種子等其他器官的生長(zhǎng)發(fā)育過程。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步研究CoSOC1-like基因在油茶中的成花機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了油茶的CoSOC1-like基因。CoSOC1-like 蛋白定位于細(xì)胞核，含有MADS-box、K-box、I 區(qū)和C 區(qū)，屬于典型的MIKC 型蛋白的轉(zhuǎn)錄因子；CoSOC1-like 蛋白與同屬植物茶樹的CsSOC1-like 的親緣關(guān)系最近。CoSOC1-like基因在油茶的生理分化期、雌雄蕊形成期、子房和花藥形成期的花芽中相對(duì)表達(dá)量最高，在果皮和種子中的相對(duì)表達(dá)量較低，說明CoSOC1-like基因在油茶的花芽分化中有重要的調(diào)節(jié)作用。本結(jié)果為進(jìn)一步研究油茶CoSOC1-like基因的功能奠定了理論基礎(chǔ)，為后續(xù)應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控CoSOC1-like基因表達(dá)水平來調(diào)節(jié)油茶花期提供了理論依據(jù)。