核桃JrWOX4b 基因的克隆和功能分析

雷夏爍，常英英,2，張 普，宋曉波＊，白永超，裴 東

(1.林木遺傳育種國家重點實驗室,國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室,中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所,北京 100091；2.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453007)

根系是植物在長期適應(yīng)陸地生境過程中形成的重要器官，是植物枝繁葉茂和抵御逆境的基礎(chǔ)。根系主要由兩種類型組成，一是在胚胎的發(fā)育過程中形成的主根，二是胚后發(fā)育過程中產(chǎn)生的根，包括側(cè)根和不定根[1]。不定根的形成會出現(xiàn)在莖和葉等器官中，它需要激素刺激細胞分裂發(fā)育成的根原基。促進“不定根的形成”是大多數(shù)林木和園藝作物無性繁殖和工廠化育苗的核心工作[2]。因此，不定根發(fā)生能力這一性狀在林木遺傳改良中占有重要的地位，不定根發(fā)生分子調(diào)控機制的解析也成為當前林木遺傳改良的重要研究內(nèi)容之一。在過去的幾十年中，有關(guān)擬南芥（Arabidopsis thalianaL.Heynh.）、水稻（Oryza sativaL.）和玉米（Zea maysL.）等草本模式植物不定根發(fā)生遺傳調(diào)控機制的研究，已經(jīng)獲得豐碩的成果[3]，而針對多年生木本植物特別是難生根木本植物不定根發(fā)生的研究卻相對缺乏。

近年來，隨著分子遺傳學(xué)和測序技術(shù)的飛速發(fā)展，各類轉(zhuǎn)錄因子在植物發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的調(diào)控作用受到越來越多的關(guān)注，其中，植物特有的WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX（WOX）基因家族[4]，能夠通過影響分生組織中干細胞的分裂和分化，調(diào)控植物生長發(fā)育過程中的胚胎發(fā)育、微管系統(tǒng)發(fā)育和側(cè)生器官發(fā)生等生物學(xué)過程[5-6]。在水稻中，OsWOX4基因被證明參與莖尖分生組織的調(diào)控，還能夠通過調(diào)節(jié)生長素在水稻初生根的極性運輸來控制水稻初生根的伸長[7]。在擬南芥中，AtWOX5與SCR、SHR、PLT基因一同調(diào)控根尖干細胞生態(tài)位的形成與穩(wěn)定[8]。在苜蓿中，MtWOX5與MtPLT、MtBBM1基因共同調(diào)節(jié)根尖分生組織的形成[9]。在楊樹中，PtoWUSa可通過調(diào)節(jié)生長素轉(zhuǎn)運基因PIN的表達，從而控制生長素的極性運輸，以此來完成對楊樹不定根發(fā)育的調(diào)控[10-11]。WOX5/7還可以在WOX11/12的作用下激活表達，進而在根原基起始過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用[12]。GhWOX13基因在棉花纖維中的特異性高表達，暗示著其對棉花纖維形成的調(diào)控作用[13]。綜上可見，WOX基因家族不同成員在功能方面存在分化，相同成員在不同物種中的作用是保守性和特異性并存的。因此，借鑒模式植物相關(guān)研究成果，并從中尋找林木特色調(diào)控機制是十分必要的。

優(yōu)良砧木無性繁育體系的建立，是實現(xiàn)經(jīng)濟林產(chǎn)業(yè)整株無性系化的關(guān)鍵。然而，核桃等經(jīng)濟林樹種很難產(chǎn)生不定根，特別是隨著樹齡的增長，其不定根發(fā)生能力顯著降低甚至完全喪失，嚴重制約了優(yōu)良砧木良種的推廣應(yīng)用。本課題組前期通過連續(xù)多次嫁接和黃化處理等手段，成功誘導(dǎo)成齡植株復(fù)幼，結(jié)合IBA（3-吲哚丁酸）等生長調(diào)節(jié)劑處理，實現(xiàn)了核桃等多個難生根樹種的高效扦插繁殖[14]。并通過對WOX基因家族的表達模式分析發(fā)現(xiàn)，JrWOX4b基因的表達水平發(fā)生在不定根發(fā)生過程中顯著上調(diào)表達，推測其在不定根發(fā)生過程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用[15]。因此，本研究在前期工作基礎(chǔ)之上，通過對JrWOX4b基因的克隆、生物信息學(xué)分析和亞細胞定位，分析其序列和表達特性，重點通過對‘84K’楊的遺傳轉(zhuǎn)化和表型分析鑒定其在不定根發(fā)生方面的作用，研究結(jié)果不僅有助于豐富植物器官從頭建成的發(fā)育生物學(xué)理論，也能指導(dǎo)開展植物優(yōu)良品種的快速繁殖，對農(nóng)、林、園藝的發(fā)展都具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

核桃品 種‘ 林早香’（Juglans regia‘Linzaoxiang）’幼嫩葉片用于總RNA 提取和基因克 ??；3 周齡銀腺楊‘84K’（Populus alba×P.glandulosacl.'84K'）無菌苗自上而下第3～4 片葉片用于遺傳轉(zhuǎn)化；4～5 周齡野生型煙草自上而下第6～8 片葉片用于亞細胞定位分析。核桃品種‘林早香’2 年生盆栽苗和野生型煙草植株均保存在中國林科院科研溫室?！?4K’楊無菌苗保存于林木遺傳育種國家重點實驗室組培室，培養(yǎng)條件為：溫度23～25 ℃，光照周期16/8 h（光照/黑暗）。

1.2 方法

1.2.1 核桃JrWOX4b基因CDS 的克隆和生物信息學(xué)分析 總RNA 的提取使用EASY spin Plus植物總RNA 快速提取試劑盒（艾德萊，北京），1.0%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000 微量分光光度計檢測總RNA 完整性和濃度。PeimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）合成cDNA 第一鏈。根據(jù)NCBI 中登陸的核桃JrWOX4b的基因序列（Genbank 登錄號：XM_019000128.1）設(shè)計JrWOX4b基因CDS區(qū)全長序列的PCR 擴增引物（表1），以‘林早香’核桃的cDNA 為模板進行PCR 擴增。利用在線工具ExpasyProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）對JrWOX4b基因序列特征進行分析，氨基酸序列多重比對和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建使用MEGA軟件[16]完成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.2 JrWox4b 蛋白亞細胞定位分析 根據(jù)前期克隆得到的JrWOX4b基因CDS 序列（引物見表1），通過gateway 系統(tǒng)BP 反應(yīng)將其連接至中間載體pDONR222.1 并測序，隨后將目的基因亞克隆至載體 pEarlyGate104，得 到35::YEPJrWOX4b的融合表達載體，電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)OD600至0.5～1.0，離心后用侵染液重懸菌液至OD6000.8 左右，并注射煙草葉片。培養(yǎng)2 d 后，使用共聚焦顯微鏡（LSM510）進行JrWOX4b 蛋白的亞細胞定位觀察，熒光成像參數(shù)為YFP/FM464:488/543 nm 和505～530/585 nm 接受濾鏡。

1.2.3JrWox4b基因植物過表達載體構(gòu)建及‘84K’楊遺傳轉(zhuǎn)化 通過Gateway 系統(tǒng)的BP 反應(yīng)構(gòu)建JrWOX4b基因的入門載體P1-JrWOX4b-P2，通過LR 反應(yīng)將JrWOX4b基因構(gòu)建于過表達載體PMDC32 中，得到35::JrWOX4b過表達載體，并通過電擊法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101 中，參照張利[17]的方法，通過葉盤法轉(zhuǎn)化‘84K’楊：以生長3 周的‘84K’楊組培苗（頂端向下3～4 片葉片）為材料，農(nóng)桿菌菌液OD600培養(yǎng)至0.6～0.8 后，將葉片在菌液中浸泡10 min，用濾紙吸凈表面菌液后轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+3 mg·L-1潮霉素+200 mg·L-1特美汀+0.5 mg·L-16BA+0.05 mg·L-1NAA）上誘導(dǎo)和篩選不定芽。在經(jīng)過大約30 d 的不定芽誘導(dǎo)后將抗性不定芽更換至生根培養(yǎng)基（1/2MS+3 mg·L-1潮霉素+200 mg·L-1特美汀+0.05 mg·L-1IBA）的誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基，直至誘導(dǎo)出不定根。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定 提取轉(zhuǎn)基因抗性植株和對照‘84K’植株的基因組DNA，PCR 檢驗?zāi)康幕虻牟迦?。利用篩選出的陽性轉(zhuǎn)基因植株為材料，提取抗性植株總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRTPCR 檢測JrWOX4b基因在轉(zhuǎn)基因植株中的相對表達量（引物序列見表1）。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因‘84K’楊不定根相關(guān)表型分析 每個陽性遺傳轉(zhuǎn)化株系和對照‘84K’株系分別擴繁至30 株。取莖尖扦插于不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)不定根發(fā)生。誘導(dǎo)0～6 d 內(nèi)在體視顯微鏡下觀察莖段基部的形態(tài)學(xué)變化。誘導(dǎo)后14 d 統(tǒng)計不定根數(shù)量和長度。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理和分析 通過Microsoft Excel 和SPSS18.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行整理和單因素方差分析，顯著性差異水平設(shè)定為0.05，當P≤0.05時表示對比的樣本間有顯著性差異。

2 結(jié)果分析

2.1 核桃JrWOX4b 基因克隆和生物信息學(xué)分析

以‘林早香’核桃葉片cDNA 為模板進行JrWOX4b基因的PCR 擴增，切膠回收和測序結(jié)果顯示：JrWOX4b基因CDS 區(qū)長度為678 bp，編碼226 個氨基酸，分子量為25.42 KDa；理論等電點（pI）為9.16，帶負電荷殘基總數(shù)(Asp +Glu)為28，帶正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為34；脂肪族指數(shù)為54.82，平均親水性為-0.908，屬于親水蛋白，定位于細胞核。氨基酸序列多重比對結(jié)果（圖1）顯示：JrWOX4b 蛋白具有1 個同源異型HD 結(jié)構(gòu)域，屬于典型的WOX 家族成員。為了分析JrWOX4b 蛋白在不同植物間的親緣關(guān)系，應(yīng)用 MEGA7.0 軟件，采用 Neighborjoining 方法將核桃JrWOX4b 與其他9 個物種的同源蛋白進行系統(tǒng)進化分析，聚類結(jié)果顯示：核桃JrWOX4b 與山核桃屬的長山核桃（Carya illinoensis）同源蛋白遺傳關(guān)系最近，與殼斗科櫟屬白櫟（Quercus lobata）次之，而與禾本科的黍稷（Panicum miliaceum）和二柄 短穗草（Brachypodium distachyon）親緣關(guān)系最遠（圖2）。

圖1 核桃JrWOX4b 與其他植物的氨基酸序列多重比對Fig.1 The alignment of amino acid sequences of JrWOX4b in walnut and other plants

圖2 JrWOX4b 與其同源序列的系統(tǒng)進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of JrWOX4b and its homologous

2.2 亞細胞定位分析

為了確定JrWOx4b 蛋白在細胞中的表達位置，進而明確其作用機制。將35S::YFP-JrWOX4b融合表達載體在煙草葉片中瞬時表達，結(jié)果（圖3）表明：在288 nm 的條件下激發(fā)，煙草下表皮細胞的細胞核呈現(xiàn)明顯的黃色熒光信號，且細胞核的輪廓清晰。在與明場疊加后，可見35S::YFPJrWOX4b 黃色熒光蛋白表達的位置在細胞核上。

圖3 JrWOX4b 蛋白在野生煙草葉片中的亞細胞定位分析Fig.3 Analysis of Subcellular Localization of JrWOX4b Protein in Wild Tobacco Leaves

2.3 JrWOX4b 轉(zhuǎn)基因陽性植株鑒定

分別提取不同轉(zhuǎn)基因株系和對照‘84K’植株的基因組DNA，通過PCR 驗證目的基因的插入，圖4A 表明：共鑒定得到JrWOX4b基因過表達陽性株系14 個。進一步通過qRT-PCR 技術(shù)檢測JrWOX4b在對照‘84K’和轉(zhuǎn)基因注釋中的表達水平，結(jié)果（圖4B）顯示：對照組84K 中未檢測到JrWOX4b基因的表達，將11#中的基因表達量設(shè)為1，在獲得的14 個陽性株系中，OE-JrWOX4b-3#、5#、8#、9#、13#的表達量較高，均達到11#表達水平的4 倍以上。

圖4 ‘84K’楊陽性再生植株鑒定（A）和JrWOX4b 基因的相對表達量（B）Fig.4 Identification of Populus alba × P.glandulosa cl.‘84K’ positive regenerated plants (A) and relative expression of JrWOX4b gene (B)

2.4 JrWOX4b 基因過表達對‘84K’楊不定根發(fā)生的影響

為了分析JrWOX4b基因?qū)τ凇?4K’楊不定根發(fā)生的影響，選取已驗證的陽性植株進行不定根誘導(dǎo)試驗。誘導(dǎo)過程中，利用體視鏡觀察‘84K’楊莖段基部形態(tài)變化，結(jié)果（圖5A）顯示：在誘導(dǎo)5 d 時JrWOX4b-OE#9 和對照（Control）中同時觀察到莖基部出現(xiàn)不定根原基向外突出產(chǎn)生的小突起，誘導(dǎo)6 d 時，JrWOX4b-OE#9 和對照基部可觀察到不定根的出現(xiàn)。過表達株系和對照植株在不定根發(fā)生時間方面沒有顯著差異，但過表達植株的不定根粗度增加，并且根尖部位發(fā)生明顯彎曲（圖5B）。

誘導(dǎo)后14 d，過表達和對照株系的不定根相關(guān)表型分析結(jié)果顯示：JrWOX4b基因的過表達能顯著促進不定根發(fā)生數(shù)量，不定根的長度顯著縮短（圖5B）。在JrWOX4b基因過表達的植株中，不定根的數(shù)量為8.3 根，平均不定根的長度約為1.25 cm，對照‘84K’楊的平均不定根數(shù)量為3.2根，平均不定根長度為3.26 cm（圖5C、D）。

圖5 ‘84K’楊陽性轉(zhuǎn)基因植株不定根發(fā)生相關(guān)表型分析Fig.5 Phenotypic analysis of adventitious root of Populus alba × P.glandulosa cl.‘84K’ positive transgenic plants

3 討論

通常情況下具有相似的物理和化學(xué)性質(zhì)的蛋白可能具有相似的生物學(xué)功能。本研究成功地從核桃中克隆到1 個WOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員基因JrWOX4b，其編碼氨基酸的多重序列比和系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，該基因編碼的JrWOX4b 蛋白與山核桃屬的長山核桃同源蛋白具有97.79%的高相似性，并且具有典型的HOX 結(jié)構(gòu)域，說明WOX4b基因在生物演變過程中的高度保守性，同時也說明JrWOX4b基因可能具有WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族在分生組織調(diào)控方面的功能。

根原基的形成是不定根發(fā)生的先決條件。前人研究結(jié)果顯示，不定根原基原始細胞通常為具有潛在分生能力的細胞，如形成層、中柱鞘或者薄壁細胞等[18]。對于草本植物而言，不定根起始于下胚軸或葉片微管組織中的形成層細胞。在木本植物中，不定根通常起源于莖段微管組織中的形成層細胞或近緣的薄壁細胞[19]。作為植物中最重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，WOX基因家族成員在干細胞維持和分生組織中重要的調(diào)控作用已得到研究人員的廣泛關(guān)注[20]。擬南芥、楊樹等模式植物有關(guān)研究過程中也發(fā)現(xiàn)，WOX4/5/11等WOX家族成員表達水平變化會顯著影響植物的不定根發(fā)生能力[21-22]。本研究中，筆者通過對JrWOX4b基因的過表達能顯著促進轉(zhuǎn)基因‘84K’楊的不定根數(shù)量，并顯著抑制不定根的伸長，證實了其在不定根發(fā)生過程中的調(diào)控作用。植物激素在植物不定根形成中起著重要的作用，IAA 能夠通過調(diào)節(jié)茉莉酸（Jasmonic Acid,JA）的穩(wěn)態(tài)來調(diào)控不定根的形成，但JA 會破壞不定根的根尖優(yōu)勢，抑制不定根的根尖伸長[23]。ABA 對不定根的形成和發(fā)育有多種作用，較低濃度的ABA 會促進不定根的形成，但同時ABA 也會抑制不定根的伸長[24]。LkWOX4過表達植株中不定根內(nèi)JA 和ABA 含量升高，IAA 含量降低，這可能是不定根數(shù)量增多但長度縮短的原因[25]。因此，筆者推測JrWOX4b基因的過表達可能通過對轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源激素的含量和分布影響，促進了不定根的發(fā)生，同時也抑制了其伸長。這一推測，筆者將通過對轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源激素和基因表達水平的分析進一步研究。

研究過程中，筆者還觀察到JrWOX4b過表達的‘84K’楊葉片邊緣向著近軸面卷曲的現(xiàn)象。據(jù)報道，在楊樹中，PtWOX4的過量表達也會導(dǎo)致楊樹葉片的卷曲[26]，原因可能是PtWOX4的超量表達影響了葉片維管的正常發(fā)育，進而導(dǎo)致葉片與葉脈的夾角改變，與本研究中觀察到的表型相似。同樣，在水稻中，與JrWOX4b基因同屬于WUS 分支的OsWOX3b，其缺失突變體同樣也會影響水稻葉片的形狀[27]，但其中的深層機制仍需進一步的試驗探索。

4 結(jié)論

本研究從核桃葉片中成功克隆了WOX基因家族成員JrWOX4b基因，該基因編碼的蛋白具有WOX 家族成員特有的保守結(jié)構(gòu)域。亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，JrWOX4b 蛋白定位于細胞核?；蚬δ芊治鼋Y(jié)果顯示，JrWOX4b基因的過表達可顯著促進轉(zhuǎn)基因植株的不定根數(shù)量，暗示了其在不定根發(fā)生方面的重要作用。研究結(jié)果不僅能夠為其他難生根樹種不定根發(fā)生的研究提供優(yōu)良基因資源，同時也為林木和園藝作物優(yōu)良品種的快速繁殖提供理論支撐。