柴胡消石自擬方對結(jié)石性膽囊炎豚鼠膽囊病理及脂多糖、微囊蛋白-3的影響

馬亦湘，安佳琳，楊成城，張少輝，張 濤，錢嘉惠，周春宇

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078)

結(jié)石性膽囊炎是臨床常見疾病，通常由于結(jié)石導(dǎo)致膽囊管阻塞、擴(kuò)張、水腫、膽汁淤積，引起細(xì)菌感染所致[1]。西醫(yī)以抗感染及手術(shù)治療為主，但抗感染治療亦反復(fù)發(fā)作，手術(shù)治療存在術(shù)后并發(fā)癥。中醫(yī)認(rèn)為結(jié)石性膽囊炎屬于“脅痛”“膽脹”“黃疸”等范疇，其發(fā)病與肝膽氣郁密切相關(guān)[2-3]。本著中醫(yī)治病求本的原則，本課題組以大柴胡湯為基礎(chǔ)，結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)設(shè)立柴胡消石自擬方，應(yīng)用于結(jié)石性膽囊炎患者效果較好。本實(shí)驗(yàn)觀察了柴胡消石自擬方對高脂飼料誘導(dǎo)的結(jié)石性膽囊炎豚鼠膽囊病理形態(tài)及血清中脂多糖(LPS)、微囊蛋白-3(CAV-3)水平的影響，旨在進(jìn)一步探討該方的作用及機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級健康成年雌性豚鼠，體重(300±40)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號：SCXK(京)2016-0011。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(SPF級)中，室溫條件(22±2)℃，相對濕度保持在50%～60%，光照保持正常晝夜節(jié)律，并且飼養(yǎng)環(huán)境保持安靜。分籠飼養(yǎng)，每日自由飲食、飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司審核通過(20200524-01)。

1.2藥物 柴胡消石自擬方，組方：柴胡15 g、黃芩9 g、赤芍9 g、枳實(shí)12 g、大棗12 g、大黃6 g、雞內(nèi)金12 g、金銀花9 g、梔子9 g、蒲公英12 g、茵陳12 g、姜半夏8 g、白芍12 g、生姜15 g、木香9 g，顆粒劑購自北京醫(yī)珍堂中醫(yī)診所有限公司(貨號：20016996)。70 kg成年人日有效劑量為161 g，即2 300 mg/kg，參考《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[4]中人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值，豚鼠灌胃劑量=人的每日劑量(2 300 mg/kg)×70 kg×0.031/400 g=12.5 g/kg，故400g豚鼠的用藥劑量為5g/d，按照2mL/g的標(biāo)準(zhǔn)稀釋顆粒制劑，豚鼠的中藥灌胃劑量為10 mL/d。

1.3試劑及致石飼料 通用型4%組織固定液、蘇木素染液、豚鼠LPS ELISA檢測試劑盒、豚鼠CAV-3 ELISA檢測試劑盒、切片石蠟，購自北京泰科美生物科技有限公司。致石飼料：綜合參考文獻(xiàn)[5-8]的造模方法，選取酪蛋白1%、蔗糖1.5%、豬油1%、膽酸0.02%、膽固醇0.05%與普通飼料充分混合的方法，飼料購自北京歐北實(shí)驗(yàn)科技有限公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將30只豚鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為3組，每組10只。模型組和柴胡消石自擬方組豚鼠普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，連續(xù)喂以高膽固醇致石飼料4周建立結(jié)石性膽囊炎模型。造模成功后，參考文獻(xiàn)[9]方法，空白組和模型組灌胃生理鹽水10 mL/d，柴胡消石自擬方組灌胃柴胡消石自擬方顆粒劑10 mL/d，均1次/d，連續(xù)灌胃4周，各組飼料的喂養(yǎng)與灌胃前相同。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1豚鼠一般狀態(tài)及膽囊形態(tài) 實(shí)驗(yàn)過程中觀察豚鼠一般狀態(tài)，末次給藥后禁食12 h，豚鼠稱重，10%水合氯醛0.2～0.3 g/kg麻醉。固定豚鼠，解剖腹部，腹主動(dòng)脈取血后完整切除膽囊，于膽囊頸部離斷，肉眼觀察膽囊形態(tài)。取約2 mm×2 mm膽囊組織用4%組織固定液固定，用梯度濃度乙醇按75%，85%，95%的序列浸泡脫水，石蠟包埋，包埋好的蠟塊置于切片機(jī)上，切成5 μm薄片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察膽囊病理形態(tài)。

1.5.2血清LPS、CAV-3水平 取腹主動(dòng)脈血5 mL，在室溫下靜置2 h，4 ℃下3 000 r/min離心15 min，分離得到上層血清，按照LPS、CAV-3 ELISA檢測試劑盒說明操作，在450 nm波長處測量各孔的光密度。

2 結(jié) 果

2.1各組豚鼠一般狀態(tài) 空白組豚鼠體重自然增長，精神良好，反應(yīng)靈敏，動(dòng)作迅捷，呼吸平穩(wěn)，毛色光潔，大便正常；模型組豚鼠在造模過程中體重增長緩慢，精神不振，反應(yīng)遲鈍，動(dòng)作遲緩，呼吸稍弱，皮毛枯槁，蓬起易脫，眼睛黯淡無光，弓背，扎堆；灌胃后，柴胡消石自擬方組豚鼠體重、精神狀況、反應(yīng)能力、皮毛光澤度等較模型組有明顯改善，有向空白組豚鼠恢復(fù)的趨勢。

2.2各組豚鼠肉眼觀察膽囊形態(tài) 空白組豚鼠膽囊顏色紅潤，大小形態(tài)正常，血運(yùn)良好，膽汁透亮，剖開膽囊壁未見增厚，有血管附著；模型組豚鼠膽囊顏色較深，體積增大，血運(yùn)不佳，出現(xiàn)明顯的炎癥，膽汁渾濁，剖開見膽囊壁增厚，膽囊內(nèi)可見灰色泥沙樣顆粒；柴胡消石自擬方組膽囊顏色較模型組淺，但不如空白組紅潤透亮，膽汁清澈，膽囊壁輕微增厚，膽囊壁無水腫，炎癥明顯減輕，膽囊內(nèi)少量灰色泥沙樣顆粒沉淀。見圖1。

圖1 肉眼觀察空白組和結(jié)石性膽囊炎各組豚鼠膽囊形態(tài)

2.3各組豚鼠膽囊組織病理表現(xiàn) 空白組豚鼠膽囊黏膜上皮細(xì)胞呈單層柱狀整齊排列，黏膜皺襞完整，囊壁未見充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤；模型組豚鼠膽囊部分腺上皮脫落或增生，黏膜間質(zhì)水腫、充血，有大量炎性細(xì)胞浸潤；柴胡消石自擬方組豚鼠的病理改變較模型組輕，淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤不明顯。見圖2。

圖2 空白組和結(jié)石性膽囊炎各組豚鼠膽囊組織病理表現(xiàn)(HE染色)

2.4各組豚鼠血清學(xué)指標(biāo) 模型組血清LPS、CAV-3水平均明顯高于空白組(P均<0.05)；柴胡消石自擬方組血清LPS、CAV-3水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，與空白組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 空白組和結(jié)石性膽囊炎各組豚鼠血清LPS、CAV-3水平比較

3 討 論

柴胡消石自擬方基于大柴胡湯，并參考各類代表文獻(xiàn)中特效藥物，結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行加減改良而成，方中柴胡配黃芩以和解清熱，除少陽之邪；大黃配枳實(shí)共瀉陽明之熱，配茵陳則逐瘀瀉熱，另取梔子通利三焦之功，三藥合用則導(dǎo)瘀熱至二便而去；方中加芍藥以柔肝緩急止痛，緩解腹中痛，與枳實(shí)配伍可理氣和血，疏肝而不傷肝；加半夏、生姜?jiǎng)t可調(diào)和脾胃，緩解惡心嘔吐；加金銀花、蒲公英以清熱利濕；加木香以行氣止痛；配雞內(nèi)金以排石消石。諸藥合用，共同發(fā)揮清熱利濕、排石消石、疏利肝膽止痛之功。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金銀花、蒲公英、木香、梔子、茵陳能增加膽囊平滑肌張力，調(diào)節(jié)膽汁流量，并促進(jìn)膽囊收縮和膽汁排泄，具有明顯的利膽功效[10-13]。因此，不論是從中藥方劑的功效及配伍，還是從現(xiàn)代中藥藥理研究來看，柴胡消石自擬方具有明顯的利膽消石功效。

結(jié)石性膽囊炎通常由于結(jié)石堵塞膽囊管，引起膽汁排泄不暢而滯留膽囊內(nèi)，導(dǎo)致膽囊黏膜層受到淤積膽汁中膽汁酸刺激和胃腸道細(xì)菌移位或者門靜脈菌血癥等因素影響[14-15]，進(jìn)而出現(xiàn)水腫、充血、炎癥反應(yīng)等病理改變。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料誘導(dǎo)構(gòu)建豚鼠結(jié)石性膽囊炎模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)束見模型組豚鼠膽囊黏膜間質(zhì)水腫、充血、炎細(xì)胞浸潤，與上述研究的結(jié)石性膽囊炎病理表現(xiàn)一致。經(jīng)柴胡消石自擬方灌胃后，膽囊內(nèi)無明顯淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤，水腫減輕，表明柴胡消石自擬方能夠明顯減輕膽囊炎癥反應(yīng)。

LPS為重要的炎性介質(zhì)，其從細(xì)菌外壁釋放出來，通過誘導(dǎo)體內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞合成并釋放多種炎癥介質(zhì)進(jìn)而參與免疫炎癥反應(yīng)。LPS主要由革蘭陰性菌產(chǎn)生，而膽囊炎的致病菌多為革蘭陰性桿菌，當(dāng)機(jī)體受到嚴(yán)重創(chuàng)傷或出現(xiàn)嚴(yán)重感染時(shí)，全身的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙，免疫功能下降，內(nèi)毒素產(chǎn)生過多，并通過消化道吸收入血，而機(jī)體無法全部清除，同時(shí)黏膜出血壞死，屏障破壞，血清內(nèi)毒素水平明顯上升[16]。相關(guān)研究顯示，急性膽管炎時(shí)血清LPS濃度明顯升高， 而LPS可以通過合成腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和蛋白激酶C誘導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞MUC2和NUC5AC的過度表達(dá)，可能導(dǎo)致膽管黏液分泌增加和細(xì)菌感染[17-18]。此外，長期的膽囊結(jié)石可能損害腸道屏障，易發(fā)生腸道菌群移位，產(chǎn)生較多的革蘭陰性菌，這可能導(dǎo)致機(jī)體LPS 水平升高，LPS可通過腸壁進(jìn)入血流，引起全身或局部內(nèi)毒素血癥[19]。本實(shí)驗(yàn)中，通過高脂飼料誘導(dǎo)的結(jié)石性膽囊炎豚鼠膽囊內(nèi)可見泥沙樣顆粒，有明顯的結(jié)石性膽囊炎表現(xiàn)，且血清LPS水平顯著升高；經(jīng)過柴胡消石自擬方灌胃后，豚鼠結(jié)石性膽囊炎好轉(zhuǎn)，黏膜充血水腫明顯減輕，血清LPS水平明顯降低。提示柴胡消石自擬方能夠通過影響血清LPS水平調(diào)控炎癥反應(yīng)，減輕膽囊炎癥。

CAV-3是肌肉細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在膽囊平滑肌中主要存在于內(nèi)環(huán)肌，其表達(dá)受質(zhì)膜上膽固醇調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CAV-3在膽囊組織的表達(dá)增加可使膽囊收縮素受體(CCK-AR)在微囊滯留，抑制膽囊CCK-AR的表達(dá)，影響膽囊平滑肌收縮，導(dǎo)致膽囊收縮障礙，膽囊動(dòng)力低下，膽汁淤滯，促進(jìn)膽固醇結(jié)晶析出、聚集，進(jìn)而形成膽囊結(jié)石[20]。此外，CAV-3還可能通過抑制一氧化氮合酶(NOS)途徑的激活進(jìn)而減少NO的產(chǎn)生，增強(qiáng)Oddi’s括約肌收縮功能，進(jìn)而降低膽囊動(dòng)力[21]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組豚鼠血清CAV-3水平明顯升高，且肉眼觀察膽囊體積增大、囊壁增厚，有明顯的膽汁淤積表現(xiàn)，證實(shí)CAV-3對膽囊動(dòng)力有影響；經(jīng)過柴胡消石自擬方灌胃后，豚鼠血清CAV-3水平明顯降低，膽囊體積縮小，表明柴胡消石自擬方能夠通過降低血清CAV-3水平調(diào)控豚鼠膽囊動(dòng)力，進(jìn)而影響膽囊收縮運(yùn)動(dòng)，改善膽汁淤積，對結(jié)石性膽囊炎起到治療作用。

綜上所述，柴胡消石自擬方可抑制豚鼠血清中LPS、CAV-3的表達(dá)，從而明顯減輕結(jié)石性膽囊炎豚鼠膽囊的炎癥，調(diào)控膽囊動(dòng)力，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。