百里香醌對高血脂癥心肌損傷保護(hù)作用的研究

劉穎姝，姚 薇，李 珅，李欣宇，劉栩晗，王 冰，劉明明，張婷婷，華黎黎，高政南

(1. 大連理工大學(xué)附屬中心醫(yī)院，遼寧 大連 116021；2. 大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連 116044；3. 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連 116001)

高血脂癥是動脈粥樣硬化性疾病、心肌梗死及卒中的獨立危險因素[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，高血脂癥與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，會導(dǎo)致心肌細(xì)胞受損，引發(fā)心血管疾病[2]。目前臨床上治療高血脂癥的藥物主要為西藥化學(xué)制劑，包括他汀類、貝特類、煙酸及其衍生物等，這些藥物均有一定的不良反應(yīng)。中醫(yī)藥降血脂具有多靶點、多途徑的特點，因此從中草藥中提取有效成分，探尋預(yù)防和保護(hù)高血脂癥對心肌損傷的新藥有重要意義。百里香醌是一種從黑種草子中提煉出來的生物活性單體，是親氧化劑，具有抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)、抗缺血和抗血小板凝聚作用，對癌癥、肝臟疾病、糖尿病、心力衰竭、臟器缺血等多種疾病顯示出保護(hù)作用[3-7]，但其對高血脂癥心肌病變保護(hù)作用的研究較少。低密度脂蛋白受體基因敲除(LDLR-/-)小鼠因LDLR被敲除或沉默影響膽固醇的轉(zhuǎn)運，影響脂蛋白的攝取和清除，給予高脂飲食可誘發(fā)高血脂癥所致的病變[8]，因此本研究采用該小鼠探索了百里香醌對高血脂癥的心肌保護(hù)作用及其可能的機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 雄性LDLR-/-小鼠24只，體重(26.3±3.1)g，8周齡，購自北京維通利華實驗動物科技有限公司，動物合格證號：114007004738296。小鼠飼養(yǎng)條件：恒定溫度(24～26 ℃)，濕度50%～70%，標(biāo)準(zhǔn)小鼠籠飼養(yǎng),5只/籠,12 h明暗交替,自由飲水。所有實驗程序均符合《國家實驗動物管理條例》和《大連市中心醫(yī)院實驗動物管理條例》的規(guī)定。

1.2藥物 百里香醌購于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，批號：274666-1G。

1.3主要試劑及儀器 總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，兔抗清道夫受體(SR)抗體、兔抗CD36抗體、兔抗CD68抗體、兔抗過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)抗體、兔抗核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，兔抗血紅素加氧酶-1(HO-1)抗體、兔抗Smad3抗體(北京索萊寶科技有限公司),一抗稀釋劑(碧云天生物技術(shù)有限公司),抗兔通用型免疫組化檢測試劑盒(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；生物組織自動脫水機、石蠟包埋機及生物組織攤烤片機購自中國上海徠卡儀器有限公司，全波長酶標(biāo)儀購自美國伯樂公司，倒置生物顯微鏡購自日本Olimpus公司。

1.4實驗方法 將24只雄性LDLR-/-小鼠平均隨機分為3組：正常組給予普通飲食，高脂組、高脂+百里香醌組參考文獻(xiàn)[9]給予高脂飲食(含有1.2%的膽固醇和21%的脂肪)，高脂+百里香醌組同時給予百里香醌50 mg/(kg·d)溶解在玉米油溶液中灌胃，3組均干預(yù)8周。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1體重、代謝及炎癥相關(guān)指標(biāo) 干預(yù)8周結(jié)束后稱量3組小鼠體重；麻醉小鼠，下腔靜脈取血，3 000 r/min離心15 min收集血液樣本，測定血清TC、LDL-C和hs-CRP水平。

1.5.2心肌組織HE染色病理觀察 取血后處死3組小鼠，取心臟組織，用10%福爾馬林固定30 min,75%乙醇脫水過夜，石蠟包埋。將包埋的石蠟組織塊切成4 μm厚的石蠟切片，進(jìn)行HE染色后觀察：細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色。

1.5.3心肌組織Masson染色病理觀察 取10%福爾馬林固定的心臟組織，分別用75%，85%，90%，100%乙醇逐級脫水5 min，然后用石蠟包埋。將包埋的石蠟組織塊切成4 μm厚的石蠟切片，在二甲苯中浸泡3次，每次5 min，脫蠟后再用100%，90%，85%，75%乙醇水化，每次5 min，進(jìn)行Masson染色后觀察：膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維、纖維素和紅細(xì)胞呈紅色。

1.5.4心肌組織中脂質(zhì)沉積相關(guān)蛋白、氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白及Smad3表達(dá)情況 心臟組織切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉后，根據(jù)組織大小滴加按比例稀釋后的一抗[SR(1∶200)、CD36(1∶200)、CD68(1∶200)、PPAR-α(1∶200)、Nrf2(1∶350)、HO-1(1∶100)、Smad3(1∶100)]，切片平置于4℃濕盒內(nèi)過夜，后PBS沖洗 5 min×3次；滴加100 μL的生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，室溫孵育30 min后，PBS洗滌5 min×3次；滴加100 μL的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫30 min后，PBS洗5 min×3次；DAB 顯色、復(fù)染細(xì)胞核、脫水封片。在顯微鏡下,每一張切片均手動調(diào)節(jié)曝光和增益值在同一環(huán)境,隨機選取≥5個視野采集照片,采用Image J圖像分析軟件分析SR、CD36、CD68、PPAR-α、Nrf2、HO-1和Smad3陽性表達(dá)情況。結(jié)果判讀：蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，各蛋白陽性表達(dá)DAB顯色為棕黃色。

2 結(jié) 果

2.13組小鼠體重及血清TC、LDL-C、hs-CRP水平比較 干預(yù)8周后，3組小鼠體重比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；高脂組血清TC、LDL-C、hs-CRP水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，高脂+百里香醌組血清TC、LDL-C、hs-CRP水平均明顯低于高脂組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠體重及血清TC、LDL-C、hs-CRP水平

2.23組小鼠心肌組織 HE染色情況 高脂組小鼠心肌組織有大量炎性細(xì)胞浸潤，高脂+百里香醌組小鼠心肌組織炎癥細(xì)胞浸潤較少。見圖2。

箭頭處為炎性細(xì)胞浸潤圖2 各組小鼠心肌組織HE染色表現(xiàn)(×40)

2.33組小鼠心肌組織Masson染色情況 高脂組小鼠心肌組織中存在明顯膠原纖維沉積，高脂+百里香醌組膠原纖維沉積較高脂組少。見圖3。

箭頭處為膠原纖維沉積情況圖3 各組小鼠心肌組織Masson染色表現(xiàn)(×40)

2.43組小鼠心肌組織中SR、CD36和CD68表達(dá)情況 高脂組小鼠心肌組織中SR、CD36和CD68陽性表達(dá)率均明顯高于正常組(P均<0.05)，高脂+百里香醌組小鼠心肌組織中SR、CD36和CD68陽性表達(dá)率均明顯低于高脂組(P均<0.05)。見圖4及圖5。

箭頭處為染色陽性的細(xì)胞圖4 各組小鼠心肌組織中脂質(zhì)沉積相關(guān)蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色，×40)

圖5 各組小鼠心肌組織中SR、CD36和CD68陽性表達(dá)率

2.53組小鼠心肌組織中PPAR-α、Nrf2和HO-1表達(dá)情況 高脂組小鼠心肌組織中PPAR-α、Nrf2和HO-1陽性表達(dá)率均明顯低于正常組(P均<0.05)，高脂+百里香醌組小鼠心肌組織中PPAR-α、Nrf2和HO-1陽性表達(dá)率均明顯高于高脂組(P均<0.05)。見圖6及圖7。

箭頭處為染色陽性的細(xì)胞圖6 各組小鼠心肌組織中氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色，×40)

圖7 各組小鼠心肌組織中PPAR-α、Nrf2和HO-1陽性表達(dá)率

2.63組小鼠心肌組織中Smad3表達(dá)情況 正常組、高脂組、高脂+百里香醌組小鼠心肌組織中Smad3陽性表達(dá)率分別為1.0%，4.79%，2.26%，高脂組明顯高于正常組(P<0.05)，高脂+百里香醌組明顯低于高脂組(P<0.05)。見圖8。

箭頭處為染色陽性的細(xì)胞圖8 各組小鼠心肌組織中Smad3表達(dá)情況(免疫組化染色，×40)

3 討 論

hs-CRP為一種炎癥生物標(biāo)志物，根據(jù)其水平可預(yù)測心血管疾病風(fēng)險[10]。CD68為巨噬細(xì)胞標(biāo)記物，可識別巨噬細(xì)胞；CD36、SR為脂蛋白標(biāo)記物，可反映脂質(zhì)沉積情況[11-12]。LDL-C主要由SR調(diào)節(jié)，SR介導(dǎo)了巨噬細(xì)胞對氧化或乙?；揎桳DL-C的攝取代謝[13]。本實驗觀察到，高脂組LDLR-/-小鼠血清TC、LDL-C、hs-CRP水平和心肌組織中CD68、CD36、SR陽性表達(dá)率均顯著高于正常組。證實高脂飲食可導(dǎo)致LDLR-/-小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的高血脂癥及心肌組織脂質(zhì)沉積，會引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)及心肌損傷，這與既往研究高脂血癥可促進(jìn)心肌組織巨噬細(xì)胞積聚和脂質(zhì)沉積的結(jié)果一致[14]。本實驗依據(jù)文獻(xiàn)和本團(tuán)隊先前研究[4，6-7，9]，選取百里香醌50 mg/(kg·d)為干預(yù)劑量，結(jié)果高脂+百里香醌組LDLR-/-小鼠血清TC、LDL-C、hs-CRP水平和心肌組織中CD68、CD36、SR陽性表達(dá)率均顯著低于高脂組。提示百里香醌可減輕炎癥反應(yīng)，降低血脂[15]，抑制脂質(zhì)沉積，從而對高脂血癥所誘導(dǎo)的心肌損傷起到保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激在高血脂癥引起的心肌損傷中起關(guān)鍵作用。PPAR-α是參與TC和三酰甘油代謝的主要調(diào)節(jié)劑[16]。Nrf2是維持氧化平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其參與下游抗氧化酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)的啟動，通過抗氧化、抗炎和自噬機制來保護(hù)心肌[17-18]。氧化應(yīng)激存在時，Nrf2被激活解離后轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核內(nèi)，與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合后誘導(dǎo)包括HO-1等抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[19]。HO-1 是心肌中一種重要的內(nèi)源性保護(hù)因子,具有抗氧化和抗凋亡作用，其表達(dá)增加可抑制心肌細(xì)胞凋亡[20-21]。Dong等[22]發(fā)現(xiàn)，百里香醌可通過Nrf2/ARE通路減輕氧化應(yīng)激來保護(hù)神經(jīng)。本實驗中，高脂組小鼠心肌組織中PPAR-α、Nrf2和HO-1陽性表達(dá)率均明顯低于正常組，高脂+百里香醌組均明顯高于高脂組。提示百里香醌可促進(jìn)心肌Nrf2及其下游抗氧化酶靶基因HO-1蛋白表達(dá)而減輕高脂飲食誘導(dǎo)的心肌氧化應(yīng)激損傷。

心肌纖維化會導(dǎo)致心臟收縮和舒張功能障礙，其病理表現(xiàn)是心肌組織中膠原成分過度沉積伴異種膠原蛋白比例失衡[23-24]。Smad蛋白參與調(diào)節(jié)心肌成纖維細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化、遷移，是促心肌纖維化的最主要因子[25-26]。本實驗中，Masson染色顯示高脂組小鼠心肌組織中有大量膠原沉積，Smad3陽性表達(dá)率明顯高于正常組；高脂+百里香醌組小鼠心肌組織中膠原沉積較少，Smad3陽性表達(dá)率明顯低于高脂組。表明百里香醌可減輕由高血脂癥引起的心肌纖維化。

綜上所述，百里香醌可能通過抗炎癥、抗脂質(zhì)沉積、抗氧化應(yīng)激和抗心肌纖維化的作用而保護(hù)高血脂癥所誘導(dǎo)的心肌損傷，其是一種潛在的改善高血脂癥引起心損傷的藥物。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。