宣肺平喘膠囊基于p38磷酸化途徑對COPD自噬影響研究

張 曄，薛曉明，孟麗紅，李 豪，李 典，喬文曉

(1. 山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 太原 030002；2. 山西省中醫(yī)院，山西 太原 030012 )

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種主要由吸煙等原因引起的氣道和(或)肺泡異常，導(dǎo)致以咳嗽、咳痰及氣喘為主要表現(xiàn)的炎癥性肺病，是全球發(fā)病率和病死率最高的疾病之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，吸煙是COPD的首要危險因素，其他危險因素還有空氣污染、固體燃料、職業(yè)暴露和銅綠假單胞菌等[2-3]。目前COPD的傳統(tǒng)治療包括吸入糖皮質(zhì)激素及支氣管擴張劑，但其可能引發(fā)一系列不良反應(yīng)，如加重感染、骨質(zhì)疏松、白內(nèi)障等[4]，還會給患者帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)，因此，尋求治療COPD的新方法是有必要的。COPD發(fā)病機制的分子機制尚不完全清楚[5]，大量研究表明在COPD患者的肺上皮細胞、小鼠模型和細胞培養(yǎng)模型系統(tǒng)中，自噬異常激活，且持續(xù)或無效的自噬可能對肺上皮細胞有害，促進肺損傷，另外香煙誘導(dǎo)的自噬功能障礙加速了肺老化和COPD肺氣腫的加重和發(fā)病[6-8]，這都表明自噬與COPD的氣道重塑、肺實質(zhì)改變等密切相關(guān)，為臨床上治療COPD提供了新靶點。COPD屬于中醫(yī)學(xué)中“肺脹”范疇，其病性為本虛標(biāo)實。宣肺平喘膠囊是山西省中醫(yī)院中成藥制劑，其對痰瘀阻肺證COPD 有明確療效。本研究旨在探討該藥是否可通過抑制p38磷酸化對香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞自噬產(chǎn)生影響。

1 實驗材料與方法

1.1藥物 宣肺平喘膠囊由炙麻黃10 g、杏仁10 g、黃芩10 g、蘇子10 g、桔梗10 g、桑白皮15 g、紫菀15 g、款冬花15 g、葶藶子10 g、半夏10 g、甘草6 g、五味子10 g、白果10 g、當(dāng)歸15 g、黃芪30 g、蛤蚧1對組成，由山西省中醫(yī)藥研究院制劑室提供。

1.2試劑與儀器 支氣管上皮細胞株購自杭州立效生物醫(yī)藥科技公司，Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒(Cell Signaling Technology，批號C0037，C1075M)，CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：CA1210)，LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1抗體(北京索萊寶科技有限公司，貨號分別為K200040、K008014P、K101553P)，p38、p-p38抗體(Cell Signaling Technology，批號8690T、4511T)，TRIzol試劑(賽默飛世爾科技，批號：10296010)，DNA using the PrimeScript RT Reagent Kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan， ab6721)；蛋白提取試劑盒(北京基普生物科技有限公司，貨號：GPP1815)，ECL 發(fā)光試劑盒(北京基普生物科技有限公司，貨號：GPP1824)。BC-J160S 型細胞培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；M340651 型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；Attune 流式細胞儀(美國賽默飛世爾科技公司)；BX53 型熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)；CFX96型Real-time PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司)；ReadMax1800 型全波長型酶標(biāo)儀(上海閃譜生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 將支氣管上皮細胞在含有10%胎牛血清(FBS)、50 IU/mL青霉素G鈉和50 μg/mL硫酸鏈霉素的DMEM中進行培養(yǎng)，在37 ℃下 5%CO2條件下孵育，每2 d換液1次，并進行傳代培養(yǎng)。所有實驗均取對數(shù)生長的細胞。

1.3.2香煙煙霧提取物制備 將1支去過濾嘴燃燒的香煙由負壓吸引裝置連續(xù)抽吸，煙霧經(jīng)三通閥門導(dǎo)入25 mL無血清的DMEM培養(yǎng)基中制成懸液，用1 mol/L NaOH調(diào)pH=7.4，通過0.22 μm的濾器過濾除菌，得到的香煙煙霧提取物懸液定義為100%。

1.3.3含藥血清制備 選取12只健康SD大鼠，隨機平均分為空白組、宣肺平喘低劑量組、宣肺平喘中劑量組、宣肺平喘高劑量組。空白組灌胃生理鹽水，宣肺平喘低、中、高劑量組分別灌胃2.7 g/kg、5.4 g/kg、10.8 g/kg宣肺平喘膠囊溶液，2次/d，共5 d。于末次灌胃后1 h，乙醚麻醉大鼠，無菌條件下經(jīng)腹主動脈取血，靜置1 h，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min， 取上清。56 ℃水浴30 min 滅活血清，微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4細胞分組及干預(yù)方法 將支氣管上皮細胞分為空白組、香煙煙霧提取物組、宣肺平喘低劑量組、宣肺平喘中劑量組、宣肺平喘高劑量組，空白組以空白血清干預(yù)，宣肺平喘各組分別加入相應(yīng)劑量宣肺平喘含藥血清干預(yù)，培養(yǎng)6 h、12 h、18 h、24 h。收獲細胞，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ拷M3個復(fù)孔，每實驗重復(fù)3次。

1.3.5檢測指標(biāo)及方法

1.3.5.1CCK-8法檢測細胞活力 以每孔5 000個細胞的初始密度將細胞種植在96孔板上，附著過夜。在香煙煙霧提取物暴露前1 h，用不同劑量宣肺平喘含藥血清預(yù)處理細胞。24 h后加入10 μL CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2 h，采用全自動酶標(biāo)儀在450 nm處檢測各孔細胞吸光度。實驗重復(fù)3次。

1.3.5.2流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況 將不同劑量宣肺平喘含藥血清與香煙煙霧提取物刺激支氣管上皮細胞共孵育5 h后，收集細胞，PBS洗滌3次，冷藏于500 μL 1×緩沖液中重懸，與5 μL Annexin-V- FITC和2.5 μL PI試劑混合均勻，室溫避光孵育10 min，通過流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.3.5.3免疫組化檢測自噬情況 香煙煙霧提取物處理細胞24 h后，將不同濃度的宣肺平喘含藥血清與香煙煙霧提取物刺激支氣管上皮細胞共孵育5 h，然后用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS洗滌3次。用0.5% TritonX-100孵育細胞20 min，PBS洗滌3次，搖勻。用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉細胞60 min，加入一抗(LC3B)，4 ℃振蕩孵育一夜，然后用 TBST沖洗細胞。加入二抗，細胞孵育過夜,用熒光顯微鏡觀察細胞。

1.3.5.4Western blot法 檢測細胞中p38、p-p38、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白表達情況收集各組細胞，提取總蛋白，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA試劑盒測定總蛋白濃度；制備基礎(chǔ)膠和分離膠；每個梳子孔加入30 μg總蛋白，電泳90 min；轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，剪切蛋白條帶；封閉；4 ℃過夜孵育一抗；TBST清洗；二抗孵育2 h；TBST清洗；ECL顯色。一抗和二抗按照抗體說明書進行稀釋。

1.3.5.5RT-PCR法 檢測細胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1 mRNA表達情況，使用TRIzol試劑提取細胞中的總RNA，并參照說明書使用Prime Scriptr RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBRr Premix Ex TapTM Ⅱ?qū)DNA樣品進行RT-PCR。反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；40個PCR循環(huán)[95 ℃ 5 s,60 ℃ 40 s(收集熒光)]。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴增反應(yīng)結(jié)束后，95 ℃ 10 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s；并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃(儀器自動進行-Ramp Rate為0.05 ℃/s)。每個樣本的目的基因和內(nèi)參基因分別進行 RT-PCR反應(yīng)，每個樣本檢測3個復(fù)孔。 數(shù)據(jù)由QuantStudio 7 Flex檢測系統(tǒng)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組細胞活力 香煙煙霧提取物組及宣肺平喘各組細胞活力均明顯低于空白組(P均<0.05)，宣肺平喘高劑量組明顯高于香煙煙霧提取物組(P<0.05)，但宣肺平喘各組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1。

圖1 空白組和香煙煙霧提取物各組支氣管上皮細胞活力

2.2各組細胞凋亡情況 香煙煙霧提取物組及宣肺平喘各組細胞凋亡率均明顯高于空白組(P均<0.05)，宣肺平喘中、高劑量組均明顯低于香煙煙霧提取物組(P均<0.05)，宣肺平喘中、高劑量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 空白組和香煙煙霧提取物各組支氣管上皮細胞凋亡率

2.3各組細胞中自噬表達水平 香煙煙霧提取物組及宣肺平喘各組均出現(xiàn)明顯細胞自噬，自噬小體積累，LC3-Ⅱ-GFP陽性細胞表達率均明顯高于空白組(P均<0.05)，但宣肺平喘各組LC3-Ⅱ-GFP陽性細胞表達率均明顯低于香煙煙霧提取物組(P均<0.05)，且宣肺平喘低、中、高劑量組呈劑量依賴性降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖3。

圖3 空白組和香煙煙霧提取物各組支氣管上皮細胞自噬指標(biāo)LC3-Ⅱ-GFP陽性細胞表達情況

2.4各組細胞中p38、p-p38蛋白表達情況 香煙煙霧提取物組及宣肺平喘各組細胞中p-p38 蛋白表達量均明顯高于空白組(P均<0.05)，p38蛋白表達量與空白組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；宣肺平喘各組細胞中p-p38 蛋白表達量均明顯低于香煙煙霧提取物組(P均<0.05)，且宣肺平喘中、高劑量組均明顯低于宣肺平喘低劑量組(P均<0.05)。見圖4。

圖4 空白組和香煙煙霧提取物各組支氣管上皮細胞中p38、p-p38 蛋白表達情況

2.5各組細胞中自噬相關(guān)指標(biāo)LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白及mRNA表達情況 香煙煙霧提取物組及宣肺平喘各組細胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白及mRNA表達量均明顯高于空白組(P均<0.05)；宣肺平喘各組細胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白及mRNA表達量均明顯低于香煙煙霧提取物組(P均<0.05)，且宣肺平喘高劑量組LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白及mRNA表達量均明顯低于宣肺平喘低、中劑量組(P均<0.05)。見圖5及圖6。

圖5 空白組和香煙煙霧提取物各組支氣管上皮細胞自噬相關(guān)指標(biāo)蛋白表達情況

圖6 空白組和香煙煙霧提取物各組支氣管上皮細胞自噬相關(guān)指標(biāo)mRNA表達情況

3 討 論

COPD是一種以進行性的氣流受限和持續(xù)性的呼吸道癥狀為主的呼吸系統(tǒng)疾病，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[8]。細胞自噬是損壞的、衰老的細胞組織在溶酶體中降解的一種自噬途徑[9]。自噬過程中產(chǎn)生氨基酸等各種細胞代謝所需的原料，是在特殊條件下維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要途徑。近年來對于自噬與COPD的相關(guān)性研究增多。自噬是真核細胞對自身功能失調(diào)的組織進行的一種程序性死亡，自噬相關(guān)蛋白Beclin 1與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2或Bcl-XL 相互結(jié)合，導(dǎo)致Beclin 1形成吞噬泡，在LC3 Ⅰ/Ⅱ作用下延長包繞線粒體并發(fā)育成熟，然后與溶酶體結(jié)合，引發(fā)線粒體自噬，適當(dāng)?shù)淖允煽梢跃S持細胞功能的穩(wěn)定，但過度的自噬會導(dǎo)致細胞功能失調(diào)[10-11]。p38是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的重要成員，參與了多種炎癥細胞因子和應(yīng)激信號的傳導(dǎo)，在細胞分化、凋亡等過程中均有重要作用[12]。p38通路與細胞自噬調(diào)控顯著相關(guān)，抑制p38磷酸化能顯著降低細胞自噬水平[13]。

中醫(yī)認為COPD主要是由于肺脾氣虛、腎不納氣導(dǎo)致氣機不利，痰阻氣道，引起胸中憋悶脹滿、氣短等癥狀，屬“喘證”“肺脹”范疇，治療時發(fā)作期以化痰平喘為主，緩解期以補肺健脾益腎為法。宣肺平喘膠囊具有宣肺平喘、化痰止咳的作用，其適應(yīng)證與COPD的主要病機相吻合。組方中炙麻黃的有效成分麻黃堿、偽麻黃堿通過阻止過敏介質(zhì)的釋放來發(fā)揮平喘作用；黃芩的有效成分黃芩素、黃芩苷等通過多種環(huán)節(jié)影響花生四烯酸代謝，不同程度地抑制前列腺素和白細胞三烯的生成，從而減輕炎性介質(zhì)擴張血管、增加血管壁通透性及白細胞的趨化作用[14]。其他如桑白皮、葶藶子、蘇子、紫菀均能夠抑制炎癥因子TNF-α、IL-8、IL-1β的釋放，具有類似抗生素的作用[15-16]。前期臨床研究證實，宣肺平喘膠囊可明顯緩解COPD患者咳嗽、咳痰癥狀，改善肺功能，減少患者急性加重次數(shù)[17-18]。動物實驗證實宣肺平喘膠囊可顯著減輕COPD大鼠的氣道炎癥和氣道組織結(jié)構(gòu)改變，能降低血清中炎癥因子表達[19-21]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，宣肺平喘膠囊可以不同程度阻礙細胞中自噬流，抑制自噬小體蓄積，還可以顯著抑制p38磷酸化，同時減少Beclin 1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白及mRNA表達，因此推測宣肺平喘膠囊可以顯著抑制香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞自噬，而這一作用可能與抑制p38 磷酸化密切相關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。