肝母細(xì)胞瘤Wnt/β-catenin信號(hào)通路研究進(jìn)展

俞星雨 顧松 李云潔 喬夢(mèng)媛 岑宇航

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心普外科,上海 200127

肝母細(xì)胞瘤(hepatoblastoma,HB)是兒童最常見的肝臟惡性腫瘤，占兒童惡性腫瘤總數(shù)的1%，常見于3歲以下患兒。作為胚胎源性腫瘤，HB由胚胎發(fā)生過程中出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化的肝細(xì)胞前體細(xì)胞產(chǎn)生。Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常是肝母細(xì)胞瘤發(fā)生的主要原因，肝母細(xì)胞瘤也是人類癌癥中CTNNB1(編碼β-catenin的基因)突變率最高的腫瘤之一[1]。目前手術(shù)切除和以順鉑為基礎(chǔ)的化療是HB治療的主要手段，但仍有20%的病例預(yù)后不良。因此，尋找合適的靶點(diǎn)對(duì)HB進(jìn)行靶向治療具有重大的研究意義。本文旨在敘述Wnt/β-catenin信號(hào)通路在肝母細(xì)胞瘤中的研究進(jìn)展，并探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路在HB鑒別診斷、治療和預(yù)后中的應(yīng)用前景。

一、Wnt/β-catenin信號(hào)通路

Wnt通路主要由四個(gè)部分組成，分別是細(xì)胞外的Wnt配體蛋白、細(xì)胞膜上的受體、胞漿內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)部分和核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控部分，可分為依賴β-catenin的經(jīng)典途徑和不依賴β-catenin的非經(jīng)典途徑[2-3]。同時(shí)Wnt通路還可受其他分子的調(diào)控，與其他通路相互作用。在成熟的健康肝臟中，Wnt途徑大多是無活性的，但在細(xì)胞更新、再生的過程中以及某些病理狀況下可被重新激活[4]。

經(jīng)典Wnt途徑以β-catenin為核心分子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和分化中起重要作用。正常Wnt/β-catenin信號(hào)在成年肝組織中的失活是通過破壞復(fù)合物和拮抗劑的平衡調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)的。但在異常情況下，β-catenin無法被降解，從而在細(xì)胞質(zhì)中積累，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，打開下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[5]。

經(jīng)典的Wnt通路還可與其他分子和通路相互作用，如磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)可與Wnt相互作用，激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路[6]。而神經(jīng)激肽-1受體(NK-1 receptor,NK-1R)的阻斷則會(huì)抑制經(jīng)典Wnt途徑，HB細(xì)胞生長(zhǎng)速度也隨之下降，因此P物質(zhì)(substance P,SP)/NK1R復(fù)合物是包括HB在內(nèi)的多種腫瘤的抗癌靶點(diǎn)[7]。除此之外，核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β,TGF-β)等也被認(rèn)為與Wnt/β-catenin信號(hào)通路存在相互作用[8]。這些通路和分子都為HB的靶向治療提供了可能性。

非經(jīng)典Wnt途徑是β-catenin非依賴性的Wnt通路，它更多地與分化、細(xì)胞極性和遷移相關(guān)，因其依賴的核心分子不同而分為許多不同的種類，調(diào)控不同的生理過程。其中最典型的是細(xì)胞平面極性通路(Wnt/polarity通路)，它可在胚胎發(fā)育階段調(diào)控細(xì)胞骨架重排，參與原腸胚的形成[9]。

以上經(jīng)典和非經(jīng)典通路并不是獨(dú)立工作、互不打擾的，而是相互交叉、相互影響，在胚胎發(fā)育、干細(xì)胞生長(zhǎng)、組織穩(wěn)態(tài)等復(fù)雜過程中共同扮演重要角色。

二、Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常促進(jìn)HB發(fā)生發(fā)展

大量研究已經(jīng)證實(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常與HB的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系。在正常肝組織中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路一般處于非活性狀態(tài)，僅在肝臟發(fā)育、細(xì)胞分化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。而基因突變、遺傳表觀修飾的異常以及部分蛋白、分子的異常表達(dá)都會(huì)導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活，進(jìn)一步影響HB的發(fā)生發(fā)展。

(一)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因的突變

CTNNB1基因突變是Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常的常見原因。該基因編碼β-catenin蛋白，其外顯子3的框內(nèi)缺失或錯(cuò)義突變會(huì)阻止β-catenin的磷酸化，進(jìn)而阻礙其降解，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中聚積[10]。細(xì)胞核中積累的β-catenin與T細(xì)胞因子/淋巴樣增強(qiáng)因子(T-cell factor/lymphoid enhancer-binding factor,TCF/LEF)家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，招募共激活因子打開下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝母細(xì)胞瘤的發(fā)生[5]。根據(jù)Stefania等[11]的研究，CTNNB1在不同HB亞型中的突變存在差異。在純胎兒型HB中為CTNNB1的大缺失，包括第3和第4外顯子的一部分，而在胚胎型HB中則局限于第3外顯子的點(diǎn)突變。整體而言，60%～80%的HB可發(fā)生CTNNB1突變。

(二)遺傳表觀修飾異常

遺傳表觀修飾的異常是導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活的重要原因。近年來表觀遺傳調(diào)節(jié)(包括DNA甲基化、組蛋白乙?；?、RNA甲基化等修飾)作為癌癥治療的新靶點(diǎn)受到關(guān)注。在HB中，甲基化修飾的異常已得到廣泛研究，而組蛋白乙酰化修飾的相關(guān)研究仍較為缺乏。

目前研究發(fā)現(xiàn)，HB中的基因顯示出整體低甲基化，伴有特定腫瘤抑制基因 (specific tumor suppressor genes,TSGs) 的高甲基化[12]。例如APC基因在HB中由于DNA的高甲基化失去功能，因此β-catenin無法與APC蛋白結(jié)合而降解，過量的β-catenin蛋白在細(xì)胞核聚積，進(jìn)而通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)HB的發(fā)生發(fā)展[13]。Carrillo-Reixach等[14]的研究通過不同程度的DNA低甲基化和CpG島高甲基化鑒定出2個(gè)表觀基因組簇(Epi-CA、Epi-CB)，定義了第一個(gè)HB分子風(fēng)險(xiǎn)分層(molecular risk stratification of HB,MRS-HB)，改進(jìn)了目前的臨床風(fēng)險(xiǎn)分層方法。

RNA編輯的失調(diào)也是HB發(fā)生發(fā)展的重要原因，例如信使RNA中N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修飾的異常。經(jīng)m6A-seq分析可得，與Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)的基因CTNNB1、CCND1和NKD1中m6A甲基化增加。研究認(rèn)為HB中高表達(dá)的甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3(methyltransferase-like 3,METTL3)通過調(diào)節(jié)m6A修飾激活CTNNB1，使Wnt/β-catenin信號(hào)升高，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[15]。

(三)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白、分子的異常表達(dá)

癌蛋白Myc是公認(rèn)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路的直接靶標(biāo)之一，在超過80%的HB患者中都能檢測(cè)到強(qiáng)c-Myc免疫反應(yīng)性[10]。使用n-Myc抑制劑可引起HB細(xì)胞紡錘體紊亂和(或)凋亡，這為靶向治療提供了可能[16]。

轉(zhuǎn)錄因子YAP是Hippo通路的主要下游效應(yīng)分子，與β-catenin協(xié)同誘導(dǎo)HB形成[17]。根據(jù)核定位發(fā)現(xiàn)YAP在大約80%的人類HB樣本中被激活，YAP/TAZ的活化上調(diào)可促進(jìn)HB的形成[16,18]。而NFE2L2/NRF2轉(zhuǎn)錄因子的突變或過表達(dá)可加速由Wnt/β-catenin和Hippo通路突變產(chǎn)生的肝母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)，以及腫瘤相關(guān)的囊腫和壞死[19]。這也為HB更精細(xì)的分類和治療設(shè)計(jì)提供了依據(jù)。

大腦表達(dá)的X連鎖蛋白1(brain-expressed X-linked protein 1,BEX1)與人類 runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(human runt-related transcription factor 3,RUNX3)建立相互作用來阻斷其對(duì)β-catenin轉(zhuǎn)錄的抑制，從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，并在HB中維持干性[20]。因此，BEX1可以成為HB有價(jià)值的治療靶點(diǎn)。

三、Wnt/β-catenin通路在HB臨床中的應(yīng)用

(一)Wnt/β-catenin信號(hào)通路與HB鑒別診斷

目前，HB主要依靠影像學(xué)和病理學(xué)檢查進(jìn)行診斷，其中甲胎蛋白是最常使用的指標(biāo)，也可聯(lián)合β-catenin、胰島素樣生長(zhǎng)因子2(insulin-like growth factor-2,IGF-2)等生物標(biāo)志物以及部分miRNAs的表達(dá)水平幫助明確診斷。

β-catenin是鑒別肝母細(xì)胞瘤亞型的重要依據(jù)之一。肝母細(xì)胞瘤根據(jù)組織病理學(xué)特征分為上皮型和混合上皮間質(zhì)亞型，定義為C1和C2[21]。在這兩種亞型中，β-catenin突變率相似，但定位有差異，在C1型腫瘤中靠近質(zhì)膜，而在C2型中主要位于細(xì)胞核[22]。

Huang等[23]對(duì)18個(gè)未處理的HB樣本和22個(gè)新輔助化療后的HB樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶標(biāo)谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)可作為新型免疫組織化學(xué)標(biāo)記物用于肝臟腫瘤的鑒別診斷，是肝臟腫瘤中Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化的標(biāo)志。HB中常見核β-catenin染色和彌漫性GS染色，該方法對(duì)化療后殘留的腫瘤細(xì)胞鑒定效果更好[23]。

(二)Wnt/β-catenin信號(hào)通路與HB靶向治療

針對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑大致可分為生物抑制劑(單克隆抗體和重組核酸)和小分子化合物(常規(guī)藥物和新型藥物)兩類。生物抑制劑包括抗Wnt抗體、β-catenin siRNA等。使用抗Wnt抗體可誘導(dǎo)過表達(dá)Wnt-1的腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制小鼠腫瘤生成，具有特異性和選擇性[24]。而β-catenin siRNA可以特異性抑制β-catenin的表達(dá)，降低β-catenin的下游信號(hào)活性。一些miRNA也可通過抑制β-catenin表達(dá)來滅活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，延長(zhǎng)G0/G1期并縮短S期，抑制體外腫瘤細(xì)胞的增殖[25]。

乳腺癌雌激素調(diào)控基因1(growth regulating estrogen receptor binding 1,GREB1)被發(fā)現(xiàn)可以作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的靶基因，對(duì)HB的發(fā)生發(fā)展具有重要意義，可能成為治療HB的分子靶點(diǎn)[26]。GREB1作為核蛋白，可針對(duì)性使用核酸來抑制。GREB1反義寡核苷酸(GREB 1 antisense oligonucleotides,GREB1 ASOs)抑制GREB1合成，在小鼠模型中可抑制HB樣腫瘤生成，可以作為HB靶向治療的候選藥物。

具有Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制作用的化合物有塞來昔布、伊馬替尼和黃酮類藥物等。塞來昔布可將β-catenin釋放到細(xì)胞質(zhì)，并靶向糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK -3)磷酸化，同時(shí)損害酪氨酸激酶受體的自磷酸化，導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)受抑制[27]。伊馬替尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，可間接抑制β-catenin酪氨酸磷酸化[24]。而對(duì)于黃酮類藥物，研究證明天然存在的類黃酮表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)可誘導(dǎo)腫瘤抑制因子SFRP1重新表達(dá)，并下調(diào)Wnt靶基因從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)[28]。

目前來看，HB的靶向治療大多停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，需要進(jìn)一步探索。而作為較為明確的HB形成機(jī)制，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可作為靶向治療的重點(diǎn)研究方向。

(三)Wnt/β-catenin信號(hào)通路與HB預(yù)后

目前已知甲胎蛋白表達(dá)水平與HB預(yù)后、治療和復(fù)發(fā)有一定的相關(guān)性[29]。關(guān)于Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)HB臨床預(yù)后意義的實(shí)驗(yàn)研究較為缺乏，但已有研究表明β-catenin的表達(dá)及細(xì)胞核定位對(duì)HB預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)意義，其在兩種HB亞型中的定位差異導(dǎo)致了下游不同靶標(biāo)的激活，從而影響兩種不同亞型HB的預(yù)后[30]。

綜上所述，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活會(huì)導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞核中蓄積，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，這一現(xiàn)象是HB的主要標(biāo)志。Wnt/β-catenin信號(hào)通路中相關(guān)基因的突變、表觀修飾的改變以及相關(guān)蛋白、分子的異常表達(dá)可影響HB的發(fā)生發(fā)展。目前已有針對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路及其相關(guān)通路中一些靶點(diǎn)的HB治療藥物，并在細(xì)胞水平或動(dòng)物模型中進(jìn)行了研究，但尚未在HB臨床治療中推廣應(yīng)用。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在HB臨床預(yù)后中的作用還有待進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明文獻(xiàn)檢索為俞星雨、喬夢(mèng)媛、李云潔、岑宇航，觀點(diǎn)梳理為俞星雨，論文撰寫為俞星雨、喬夢(mèng)媛、李云潔、岑宇航，論文審校為顧松