非綜合征型先天性小耳畸形的病因研究進(jìn)展

謝眾，趙斯君

(南華大學(xué)兒科學(xué)院 湖南省兒童醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

先天性小耳畸形包括綜合征型小耳畸形和非綜合癥型小耳畸形，綜合征型小耳畸形大多能找到明確的病因，如鰓耳腎綜合征(branchio-otorenal-syndrome，BOR)、Treacher Collins綜合征(Treacher Collins symdrome,TCS)、Miller綜合征 (Miller syndrome, MS)等綜合征型小耳畸形分別與EYA1、SIX5、TCOF1、DHODH基因有關(guān)[1]。非綜合征型小耳畸形占到小耳畸形的絕大多數(shù)，達(dá)到 77%～93%，非綜合征型小耳畸形主要表現(xiàn)為外中耳畸形，包括耳廓結(jié)構(gòu)發(fā)育不良甚至無(wú)耳畸形，外耳道閉鎖或狹窄等，常伴有傳導(dǎo)性為主的聽(tīng)力損失，偶可伴發(fā)面神經(jīng)、前庭導(dǎo)水管畸形[2-3]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)非綜合征型小耳畸形在同卵雙胞胎中的發(fā)病率 (38.5%) 遠(yuǎn)大于異卵雙胞胎 (4.5%)[4]。此外，從組織胚胎學(xué)的角度來(lái)看，外中耳的發(fā)育起源于內(nèi)胚層第一咽囊，外胚層第一、二鰓弓及其所包含的第一鰓裂，以及其間的中胚層間充質(zhì)[5]。神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移、分化形成的第一、二鰓弓，耳廓由第一、二鰓弓之間間充質(zhì)細(xì)胞形成6個(gè)耳丘，逐漸演變而來(lái)，外中耳結(jié)構(gòu)在胚胎30周內(nèi)完成，內(nèi)耳起源于表面外胚層，于23周內(nèi)完成，所以，絕大部分非綜合征型小耳畸形不包含有內(nèi)耳畸形。因此，非綜合征型小耳畸形可能在具有遺傳易感性因素存在的前提下，經(jīng)歷孕期不良環(huán)境因素，都能夠影響腦神經(jīng)嵴細(xì)胞向第一、二鰓弓遷移、分化，進(jìn)而導(dǎo)致非綜合征型小耳畸形的發(fā)生。

1 神經(jīng)嵴細(xì)胞假說(shuō)

1.1 神經(jīng)嵴細(xì)胞

主要分為4個(gè)細(xì)胞群：腦神經(jīng)嵴細(xì)胞、心神經(jīng)嵴細(xì)胞、迷走神經(jīng)嵴細(xì)胞、體神經(jīng)嵴細(xì)胞。腦神經(jīng)嵴細(xì)胞是一個(gè)多功能細(xì)胞團(tuán)，參與顱面部主要組織器官的形成。耳廓的正常發(fā)育與腦神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移、增殖、分化密切相關(guān)，腦神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移、分化等逐漸形成第一、二、三、四鰓弓，其中第一、二鰓弓與顱面部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，并受到內(nèi)環(huán)境影響，一旦遷移、分化等出現(xiàn)錯(cuò)誤，可以導(dǎo)致包括小耳畸形在內(nèi)的顱面部的畸形[6]。

1.2 Wnt信號(hào)通路與神經(jīng)嵴細(xì)胞的關(guān)系

Wnt信號(hào)通路與細(xì)胞的增殖、遷移有關(guān)，該信號(hào)通路包括Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)通路、Wnt/Ca2+非經(jīng)典信號(hào)通路和Wnt/平面細(xì)胞極性通路[7]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活后，細(xì)胞內(nèi)β-catenin積累，并進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合T細(xì)胞因子/淋巴樣增強(qiáng)因子家族轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)下游基因的表達(dá)，使細(xì)胞增殖、分化和遷移[8]。Wnt/Ca2+信號(hào)通路激活后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加，以及鈣/鈣調(diào)素調(diào)節(jié)激酶Ⅱ和蛋白激酶C的激活，此信號(hào)通路中的受體包括Wnt5a、Wnt11。Wnt/平面細(xì)胞極性通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架組織來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞極性，控制細(xì)胞極化運(yùn)動(dòng)。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明Wnt5a被敲除的小鼠，表現(xiàn)出小耳畸形。畢曄發(fā)現(xiàn)Wnt11基因的過(guò)表達(dá)與先天性小耳畸形有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)Wnt1基因在先天性小耳畸形患者中的表達(dá)無(wú)下調(diào)[9]。表明Wnt信號(hào)通路雖然可以影響神經(jīng)嵴細(xì)胞的增殖、遷移導(dǎo)致先天性小耳畸形的發(fā)生。但是，Wnt信號(hào)通路家族龐大，不同的Wnt基因作用迥異。而且目前盡在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路異?？梢詫?dǎo)致小耳畸形，也不能明確其是否包括綜合征型小耳畸形。因此，研究不同類型Wnt基因?qū)δX神經(jīng)嵴細(xì)胞的作用，以及解決動(dòng)物表現(xiàn)出的小耳畸形是否為非綜合征型小耳畸形的問(wèn)題可能是下一步研究的方向。

1.3 Bmp信號(hào)通路與神經(jīng)嵴細(xì)胞的關(guān)系

Bmp信號(hào)通路是一種激酶?jìng)鲗?dǎo)系統(tǒng)，與成骨及軟骨分化密切相關(guān)。該信號(hào)通路包括經(jīng)典smad通路和非smad依賴通路。Smad通路中的信號(hào)分子smad蛋白是絲氨酸/蘇氨酸激酶受體下游的級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物，smad受體蛋白2、3、4、6、7受到刺激后，形成受體復(fù)合物，并與smad1、5、8蛋白相互結(jié)合并使之磷酸化，引起Runx轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，最終啟動(dòng)軟骨及成骨等細(xì)胞的表達(dá)。非smad依賴通路可以在MAPK信號(hào)通路中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，其中MAPK信號(hào)通路包括蛋白激酶(protein kinases,RK)信號(hào)通路、p38 MAPK信號(hào)通路和c-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK)信號(hào)通路[10-11]。相關(guān)研究表明Bmp基因是先天性小耳畸形的候選基因，其中Bmp5缺失在小鼠中可以耳廓短小[12]。但是目前在人類非綜合征型小耳畸形患者中，并沒(méi)有Bmp5基因突變的報(bào)道。因此，其下一步的研究方向應(yīng)該對(duì)非綜合征型小耳畸形，尤其是具有家族聚集性的病例行基因檢測(cè)，以探索是否有該基因突變。

1.4 Fgf信號(hào)通路與神經(jīng)嵴細(xì)胞的關(guān)系

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(fibroblast growth factor receptor,FGFR)是由FGFR1-4組成的受體酪氨酸激酶，其配體Fgfs(1-10、15-22)可以與FGFR受體結(jié)合，可以通過(guò)激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化，啟動(dòng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程[13-14]。Fgf信號(hào)血管生成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。有研究表明Fgf1-3主要影響外耳道的發(fā)育，F(xiàn)gf8、10主要影響外耳廓的發(fā)育，而且Fgfs家族部分成員的作用同Wnt家族相似，也存在重疊性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Fgf8、Fgf10基因與小耳畸形有關(guān)[15]。Fgf8、Fgf10基因與Bmp5基因一樣，在人類非綜合征型小耳畸形患者中亦未見(jiàn)有基因突變的報(bào)道。

1.5 次黃嘌呤單核苷酸酶2(inosine monophosphate dehydro genase2,IMPDH2)與神經(jīng)嵴細(xì)胞的關(guān)系

IMPDH2是鳥(niǎo)嘌呤核苷酸從頭合成途徑的關(guān)鍵酶。對(duì)于必須從頭合成核苷酸的細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。嗎替麥考酚酯是一種用于移植術(shù)后及自身免疫性疾病的免疫抑制劑，嗎替麥考酚酯經(jīng)口服后形成具有免疫抑制活性的產(chǎn)物—麥考酚酸，麥考酚酸是IMPDH的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，因?yàn)榱馨图?xì)胞對(duì)嘌呤從頭合成途徑高度依賴，不能利用補(bǔ)救合成途徑，故為淋巴細(xì)胞增殖所必須。因而廣泛應(yīng)用于肝、腎、心血管移植后預(yù)防免疫排斥反應(yīng)及系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性腎病綜合征等自身免疫性疾病的治療。Anderka等[16]報(bào)道了1例在孕期接觸嗎替麥考酚酯治療的患兒有雙側(cè)重度小耳畸形，外耳道閉鎖。Alsebayel等[17]報(bào)道了1例經(jīng)肝移植并使用了嗎替麥考酚酯的孕婦其嬰兒表現(xiàn)為雙側(cè)小耳畸形并外耳道閉鎖。Perez-Aytes等[18]總結(jié)既往文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，75%暴露于嗎替麥考酚酯的病例出現(xiàn)了單側(cè)、雙側(cè)甚至無(wú)耳畸形，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他原因?qū)е露蔚谋壤?。在IMPDH2與神經(jīng)嵴細(xì)胞的關(guān)系上，Lake 等[19]在小鼠胚胎早期敲除IMPDH2，可以出現(xiàn)高滲透性腸神經(jīng)節(jié)病，顱面骨骼發(fā)育不全、心血管畸形，表明IMPDH2介導(dǎo)的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸合成途徑對(duì)腸神經(jīng)嵴細(xì)胞及其他神經(jīng)嵴的正常發(fā)育至關(guān)重要。張楊通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)嗎替麥考酚酯大鼠胚胎整體及耳廓組織發(fā)育不良，并呈現(xiàn)劑量依賴性[6]。因此，嗎替麥考酚酯可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)IMPDH2的作用位點(diǎn)，不僅僅影響淋巴細(xì)胞的增殖，還可能抑制腦神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移、增殖，進(jìn)而導(dǎo)致小鼠耳廓畸形。這表明部分藥物具有目前還不明確的副作用，尤其是對(duì)于意外懷孕初期婦女，可能使用具有致畸作用的藥物導(dǎo)致先天性小耳畸形的發(fā)生。

1.6 表觀遺傳學(xué)與神經(jīng)嵴細(xì)胞的關(guān)系

表觀遺傳學(xué)是研究基因發(fā)生了可遺傳的改變，但是DNA序列并不發(fā)生改變的生物化學(xué)分支，主要研究miRNA、lncRNA等非編碼RNA及DNA甲基化、組蛋白修飾。miRNA是一類20～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA，miRNA在不同生物體內(nèi)普遍存在，而且具有明顯的組織特異性和表達(dá)階段特異性，成熟的miRNA與其他蛋白質(zhì)一起組成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過(guò)與靶mRNA的3UTR區(qū)域的互補(bǔ)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)翻譯水平的基因表達(dá)。魏安瑤等[20]通過(guò)敲除斑馬魚(yú)miRNA-23a,發(fā)現(xiàn)腦神經(jīng)嵴細(xì)胞向咽區(qū)遷移明顯減少，而且不能分化成熟。LncRNA是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，主要在調(diào)控基因表達(dá)和表觀遺傳修飾方面發(fā)揮作用。張玲等發(fā)現(xiàn)先天性小耳畸形患者中有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用的基因BRE表達(dá)的lncRNANR-028308上調(diào)，盡管LncRNA為非編碼RNA。但是，有研究發(fā)現(xiàn)相關(guān)miRNA、靶基因、轉(zhuǎn)錄因子和lncRNA可以構(gòu)成調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)耳的發(fā)育進(jìn)行調(diào)節(jié)，如lnc MIAT與miR-221/222-3p、ZEB2、RNF2在先天性小耳畸形患者患耳表達(dá)上調(diào)，并構(gòu)成調(diào)節(jié)鏈，可能通過(guò)影響腦神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育的HOX基因表達(dá)影響軟骨的發(fā)育，參與小耳畸形的發(fā)生[21]。甲氨蝶呤作為一種抗腫瘤藥物，主要通過(guò)對(duì)二氫葉酸還原酶的抑制而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的作用。Dawson等[22]報(bào)道了孕期暴露于甲氨蝶呤的患兒出現(xiàn)室間隔缺損及右側(cè)小耳畸形的病例，證實(shí)了甲氨蝶呤具有導(dǎo)致先天性小耳畸形的作用。林陽(yáng)洋等[23]綜述孕期服用葉酸可以減少包括先天性小耳畸形在內(nèi)的多種先天性畸形的報(bào)道，甚至可以部分減輕甲氨蝶呤的致畸作用。關(guān)于葉酸抗先天性小耳畸形的機(jī)制可能是通過(guò)為腦神經(jīng)嵴細(xì)胞增殖分裂所需的核苷酸以及組蛋白提供甲基化，并抑制腦神經(jīng)嵴細(xì)胞凋亡。但是，關(guān)于葉酸拮抗先天性小耳畸形的機(jī)制尚不清楚，仍需要較大樣本的流行病學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行支持。

1.7 內(nèi)皮素通路與神經(jīng)嵴細(xì)胞的關(guān)系

內(nèi)皮素通路可以調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移、分化，內(nèi)皮素受體表達(dá)與多種耳廓畸形有關(guān)。維甲酸被廣泛應(yīng)用于皮膚病的治療和化妝品的添加劑中，過(guò)量維甲酸對(duì)胚胎有毒性作用，維甲酸可導(dǎo)致先天性小耳畸形在內(nèi)的多種先天性畸形，并發(fā)現(xiàn)孕期接觸維甲酸導(dǎo)致畸形的發(fā)生率顯著高于未接觸者。劉磊通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明維甲酸可以導(dǎo)致小鼠小耳畸形的發(fā)生[24]。維甲酸導(dǎo)致小耳畸形的機(jī)制包括內(nèi)皮素通路在內(nèi)的多種通路及HOX基因的表達(dá)影響外耳的發(fā)育，并提示表觀遺傳學(xué)機(jī)制可能在其中發(fā)揮重要作用。此外，Gsc基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子也可以抑制內(nèi)皮素通路的表達(dá)，干擾神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移[1, 25]。說(shuō)明神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移、增殖既受環(huán)境因素(如維甲酸)的影響，同時(shí)也受到基因的調(diào)控，還有可能是基因受到環(huán)境因素的影響發(fā)生了基因突變，進(jìn)而影響神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移、增殖，導(dǎo)致第一二鰓弓發(fā)育不良，形成小耳畸形。

2 血管破裂假說(shuō)

該學(xué)說(shuō)指在胚胎第4周左右，該時(shí)期第一、二鰓弓的發(fā)育由鐙骨動(dòng)脈供血，如果在鐙骨動(dòng)脈形成之前，因面部局部組織內(nèi)出血、形成血腫，導(dǎo)致局部血循環(huán)不足與缺氧，影響神經(jīng)嵴細(xì)胞的增殖、遷移，影響第一、二鰓弓組織分化障礙，導(dǎo)致小耳畸形[26]。

2.1 抗血管生成藥物

如果胚胎時(shí)期局部血管不能形成，可造成局部供血區(qū)細(xì)胞死亡，尤其是導(dǎo)致局部腦神經(jīng)嵴細(xì)胞死亡，則可以導(dǎo)致小耳畸形的發(fā)生。沙利度胺是一種已知的致畸藥物，所導(dǎo)致的畸形包括眼、耳、面部、脊柱、肢體等多種畸形。沙利度胺本身也是一種抗血管生成藥物。Werler等[27]報(bào)道孕期服用偽麻黃堿、阿司匹林、布洛芬等具有縮血管作用的藥物與小耳畸形有關(guān)。但是，Paput等[28]報(bào)道孕期高熱孕婦服用布洛芬等退熱藥具有降低小耳畸形發(fā)生率的作用。而且，米索前列醇作為一種前列前素E1抑制藥，具有收縮血管的作用，可以導(dǎo)致子宮動(dòng)脈灌注減少，米索前列醇雖有導(dǎo)致肢體畸形的作用，卻沒(méi)有導(dǎo)致小耳畸形的報(bào)道[29]。目前關(guān)于非綜合征型小耳畸形的大部分流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)其多發(fā)生于男性多于女性，右側(cè)多于左側(cè)的臨床現(xiàn)象?？赡苁怯叶€粒體成熟較左耳晚，男性雄激素能降低線粒體的呼吸率，增加對(duì)化學(xué)性缺氧的敏感性，認(rèn)為這可能與雄激素降低線粒體對(duì)缺氧的耐受能力[30]。雖然有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)孕期服用孕酮及使用雌激素藥物，亦可以導(dǎo)致小耳畸形的發(fā)病率升高[23]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道高海拔地區(qū)小耳畸形發(fā)生率較低海拔地區(qū)明顯升高，盡管在西藏地區(qū)本地的小耳畸形的發(fā)生率并沒(méi)有較其他地區(qū)升高[1]。推測(cè)可能在胚胎發(fā)育過(guò)程中，影響第一、二鰓弓發(fā)育的因素頗多有關(guān)，沙利度胺具有抗血管生成，較縮血管藥物具有更強(qiáng)的導(dǎo)致局部血運(yùn)障礙，也更加可能導(dǎo)致局部組織缺血缺氧，影響到腦神經(jīng)嵴細(xì)胞的分裂、增殖，從而更容易導(dǎo)致小耳畸形。

2.2 機(jī)械刺激

杜佳梅等[31]通過(guò)病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)先天性小耳畸形患兒母親在流產(chǎn)史、多生史、先兆流產(chǎn)史相比正常兒童母親發(fā)生率高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此外，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明frem2缺乏可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)血腫，雖然frem2并不表達(dá)于胚胎血管上，但是frem2及其相關(guān)的frem1、fras1等均與細(xì)胞外基質(zhì)密切相關(guān)，其缺乏可以導(dǎo)致組織脆性增加，容易受到機(jī)械刺激出現(xiàn)血管破裂，影響局部組織的分化，導(dǎo)致小耳畸形[32]。流產(chǎn)次數(shù)多、多生史、先兆流產(chǎn)等對(duì)子宮有較大刺激的孕婦發(fā)生小耳畸形患兒的機(jī)率較大可能與此有關(guān)。

3 展望

綜上，非綜合征型小耳畸形常因神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移、增殖受到多種環(huán)境因素的影響，盡管沒(méi)有明確的致病基因，但是偶爾可以在非綜合征型小耳畸形患者行基因檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)基因突變的情況，所以，其病因常較綜合征型小耳畸形病因更加復(fù)雜。但是，非綜合征型小耳畸形是由腦神經(jīng)嵴細(xì)胞增殖、遷移障礙導(dǎo)致第一、二鰓弓發(fā)育異常導(dǎo)致。所以，將來(lái)關(guān)于非綜合征型小耳畸形病因研究可以從以下兩個(gè)方面進(jìn)行：①通過(guò)大樣本的流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致非綜合征型小耳畸形可靠的環(huán)境危險(xiǎn)因素；②探索該環(huán)境危險(xiǎn)因素對(duì)與腦神經(jīng)嵴細(xì)胞有關(guān)的基因?qū)用娴母淖儯詈?，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。