盆底功能障礙性疾病動物模型和生物力學(xué)測量方法

王照，平毅

盆底功能障礙性疾?。╬elvic floor dysfunctions，PFD）是一類困擾中老年女性健康的常見疾病。由于盆底韌帶、肌肉等盆底支持組織損傷松弛，患者出現(xiàn)排尿、排便障礙及盆腔器官下移等癥狀。國內(nèi)有調(diào)查發(fā)現(xiàn)，盆腔器官脫垂（pelvic organ prolapse，POP）和壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是2 種最主要的疾病[1]。據(jù)流行病學(xué)報(bào)告，不同收入的國家POP 患病率為1%～65%[2]，美國2017—2018 年非西班牙裔的成年女性SUI 患病率高達(dá)45.9%[3]。國內(nèi)一項(xiàng)多機(jī)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，2011—2018 年進(jìn)行的POP 手術(shù)量是2004—2011 年的2 倍多[4]。可見PFD 的患病率及手術(shù)增長率均不容忽視。然而目前PFD 的致病機(jī)制尚未完全明確。探索其發(fā)病機(jī)制需要將實(shí)驗(yàn)對象暴露于諸多危險因素中或?qū)ζ溥M(jìn)行多種有創(chuàng)操作，因此直接進(jìn)行人體試驗(yàn)既不現(xiàn)實(shí)，也不道德。動物實(shí)驗(yàn)不僅可以較大程度上滿足上述需求，還可以幫助解決生物材料[5]、干細(xì)胞[6]等治療方法的有效性和安全性問題，更具優(yōu)勢?，F(xiàn)圍繞2 類最主要的PFD（POP 和SUI）動物模型，總結(jié)不同模型動物及造模方法的應(yīng)用現(xiàn)況，闡述生物力學(xué)測量方法對動物模型的優(yōu)化作用，以期為探索PFD 的發(fā)病機(jī)制及治療方法提供參考。

1 動物類型

目前PFD 的動物模型根據(jù)物種的不同大致分為嚙齒類動物、小型哺乳動物、大型哺乳動物以及非人類靈長類動物（nonhuman primates）4 類。由于動物的盆底解剖結(jié)構(gòu)與人類存在差異，四足動物的腹腔器官不會直接對盆底造成負(fù)擔(dān)，盆底支持組織的壓力較低[7]，導(dǎo)致動物模型存在局限性。

1.1 嚙齒類動物大鼠（rat）和小鼠（mouse）是最常用的動物模型[8]。其不僅在探索PFD 的發(fā)病機(jī)制的研究中發(fā)揮了重要作用，也被應(yīng)用于最前沿的干細(xì)胞聯(lián)合生物材料治療PFD 的實(shí)驗(yàn)中[9]。嚙齒類動物與人類盆底肌肉韌帶組織相似，以大鼠為首[10]。嚙齒類動物相較于其他動物，繁殖周期短，可在一定程度上預(yù)測發(fā)情期與妊娠期，易于操作和處理，成本較為低廉，便于擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)規(guī)模。但由于其體積較小、四足行走以及胎頭徑與產(chǎn)道直徑的比例較小，嚙齒類動物極少發(fā)生自發(fā)性POP[10]。更明顯的局限性是，因?yàn)轶w積的原因，與生物材料相關(guān)的實(shí)驗(yàn)傾向于在嚙齒類動物的背腹部而非盆腔進(jìn)行操作[11]。這無疑在一定程度上影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

1.2 小型哺乳動物兔（rabbit）的盆底結(jié)構(gòu)與人類差異較大，家兔沒有宮頸，其陰道與人類也極為不同，陰道上部實(shí)際上是它的“宮頸”[10]。且兔需要通過性交的陰道刺激來誘導(dǎo)排卵，不利于實(shí)驗(yàn)操作。但在生物材料組織相容性的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，新西蘭白兔（New Zealand white rabbit）的適應(yīng)性比大鼠好[12]，后者常引起嚴(yán)重的炎性反應(yīng)[13]，這可能是兔用做PFD動物模型的優(yōu)勢。另外，兔的膀胱組織條帶在體外實(shí)驗(yàn)中對M 膽堿能刺激、腎上腺素能刺激作出反應(yīng)，可用作膀胱功能的體外研究系統(tǒng)[14]。

1.3 大型哺乳動物大型哺乳動物指綿羊（sheep）、山羊（goat）、豬（pig）和狗（dog）等動物。大型動物模型在PFD 的研究中具有更明顯的優(yōu)劣勢。一方面，大型動物都存在著生長期和妊娠期長、場地要求較大等問題，而且大型動物的生物學(xué)工具，如抗體、探針和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)較少，制約其在PFD 中的應(yīng)用[7]。但另一方面，大體型有助于更多手術(shù)方案的選擇，且體質(zhì)量與PFD 相關(guān)[15]，體質(zhì)量大也代表著更可能發(fā)生PFD。事實(shí)上，正常狀態(tài)未被外界干預(yù)的母羊可發(fā)生自發(fā)性POP[16]。綿羊與人體的盆底解剖結(jié)構(gòu)頗為類似，都存在三水平結(jié)構(gòu)。一些學(xué)者認(rèn)為綿羊可以作為非人類靈長類動物的替代[17]。

1.4 非人類靈長類動物用于研究的非人類靈長類動物有恒河猴、松鼠猴和狒狒等。Stewart 等[18]比較恒河猴、兔、嚙齒類動物與人類盆底肌肉的差異發(fā)現(xiàn)，恒河猴的建筑差異指數(shù)（architectural difference index）最低。恒河猴的胎兒頭部較大，分娩時需將母猴的陰道直徑擴(kuò)大5 倍，與人類的分娩過程非常相似。Zhang 等[19]通過構(gòu)建恒河猴卵巢切除模型證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞可以修復(fù)受損的陰道組織，為POP 提供了新的治療方法。亦有很多實(shí)驗(yàn)用松鼠猴構(gòu)建PFD 的動物模型。Pereira da Silva 等[20]通過分析人類與松鼠猴的盆底結(jié)構(gòu)的差異，比較兩者POP 及不良分娩結(jié)局的發(fā)生率，認(rèn)為雌性松鼠猴和人類女性之間的盆底形態(tài)雖不十分相似，但具有相似的與分娩相關(guān)的特征，可作為研究POP 的動物模型。然而，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)周期長、來源有限、價格昂貴、管理及寄宿費(fèi)用高等問題，非人類靈長類動物并不如嚙齒類動物常用。

2 造模方法

流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)PFD 有諸多危險因素。通過模擬這些危險因素，可以構(gòu)建各類動物模型來研究PFD的致病機(jī)制?；蚣夹g(shù)也可用于構(gòu)建特定性質(zhì)的動物模型。

2.1 損傷肌肉、神經(jīng)等組織陰道分娩與PFD 緊密相關(guān)[21]，模擬分娩是最主要的造模方法。分娩時胎兒通過產(chǎn)道，可能導(dǎo)致盆底肌肉、神經(jīng)損傷。通過使用擴(kuò)張導(dǎo)管來膨脹陰道（陰道擴(kuò)張）可以建立模擬分娩產(chǎn)傷的動物模型。Palacios 等[22]將F10 導(dǎo)管插入未分娩的大鼠陰道中探究陰道擴(kuò)張后大鼠尿失禁恢復(fù)的過程，闡述分娩損傷導(dǎo)致尿道外括約肌功能障礙的機(jī)制。Kishimoto 等[23]使用陰道擴(kuò)張的大鼠模型研究肛門括約肌功能受損的治療，發(fā)現(xiàn)同源和異位移植脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以改善肛門括約肌功能。然而，分娩引起的PFD 并不單一涉及肌肉和周圍軟組織的損傷，還包括氧化應(yīng)激[24]、去神經(jīng)支配[25]、細(xì)胞外基質(zhì)代謝異常[26]等機(jī)制，是一個涉及多方面的過程[27]。目前模擬分娩的造模方法只是就其中一個方面進(jìn)行模擬，仍有較大的改進(jìn)空間。

陰部神經(jīng)損傷也可以構(gòu)建SUI 模型。戴毓欣等[28]對雙側(cè)陰部神經(jīng)進(jìn)行麻醉阻滯，構(gòu)建了一種PFD盆腔神經(jīng)損傷的動物模型，用于探索盆底功能障礙的神經(jīng)損傷機(jī)制。亦有實(shí)驗(yàn)直接離斷陰部神經(jīng)，成功建立了大鼠SUI 模型[29]。也可以直接破壞尿道周圍起到支持作用及增加尿道阻力的肌肉、韌帶構(gòu)建SUI 模型，常見的實(shí)驗(yàn)方法是尿道松解術(shù)、恥骨尿道韌帶橫斷術(shù)和尿道括約肌切除術(shù)，還可使用尿道燒灼術(shù)、尿道周圍注射肉毒素等方式。

2.2 模擬其他危險因素除了分娩產(chǎn)傷，肥胖、子宮切除術(shù)史、衰老、絕經(jīng)和多產(chǎn)次等作為PFD 的其他危險因素，也可以作為構(gòu)建動物模型的切入點(diǎn)。通過Zucker 大鼠構(gòu)建肥胖-壓力性尿失禁（OA-SUI）模型，Yuan 等[30]和Wang 等[31]分別發(fā)現(xiàn)慢病毒介導(dǎo)的尿道橫紋肌再生及微能聲脈沖（microenergy acoustic pulse）刺激肌肉再生均可以改善OA-SUI 大鼠的尿失禁情況。Knight 等[32]通過構(gòu)建子宮切除術(shù)后的新西蘭白兔模型發(fā)現(xiàn)，聚丙烯補(bǔ)片對陰道平滑肌形態(tài)和收縮性有負(fù)面影響，認(rèn)為新西蘭白兔模型可以用于生物補(bǔ)片發(fā)生侵蝕暴露的相關(guān)機(jī)制的研究。Shveiky 等[33]通過構(gòu)建陰道后正中線切口的大鼠模型，發(fā)現(xiàn)衰老是陰道傷口愈合的危險因素。Shahryarinejad 等[34]通過切除獼猴的卵巢構(gòu)建更年期模型，并給予雌激素和雌激素受體調(diào)節(jié)劑，發(fā)現(xiàn)選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑可能影響子宮韌帶的生物力學(xué)和生化特性。Kwon 等[35]通過構(gòu)建模擬多次分娩的SUI 大鼠模型，驗(yàn)證漏尿點(diǎn)壓（leak point pressure）和尿道基線壓力（urethral baseline pressure）是和SUI有關(guān)的2 項(xiàng)尿動力學(xué)參數(shù)。此外還有許多以其他危險因素作為切入點(diǎn)的動物模型構(gòu)建方法，在此不一一贅述。

2.3 應(yīng)用基因技術(shù)PFD 與很多基因表達(dá)相關(guān)，Isali 等[36]總結(jié)了目前已經(jīng)明確的20 余種與PFD 相關(guān)的基因。Jameson 等[37]敲除小鼠賴氨酰氧化酶樣1（lysyl oxidase-like 1，LOXL1）基因構(gòu)建一種隨著年齡和胎次的增加而POP 發(fā)病率增加的小鼠模型，一定程度上復(fù)刻人類POP 的易感性特征，并在此基礎(chǔ)上研究LOXL1 基因遺傳缺失對彈性蛋白合成及其調(diào)節(jié)的影響。Chin 等[38]通過給予小鼠多西環(huán)素構(gòu)建部分組織（指陰道壁組織）發(fā)生腓骨蛋白5（fibulin-5）基因缺陷的小鼠模型，這種小鼠缺乏對分娩及彈性蛋白酶所誘導(dǎo)的POP 的自我修復(fù)，與產(chǎn)婦及中老年女性大致相似，組織特異性的基因敲除不會引起全身的癥狀?？梢?，實(shí)驗(yàn)者應(yīng)用基因技術(shù)可以構(gòu)建特定性質(zhì)的動物模型，得到與人類相似的PFD 發(fā)病轉(zhuǎn)歸過程。

3 生物力學(xué)與動物模型

3.1 生物力學(xué)生物力學(xué)是對生物體中的力學(xué)問題定量研究的一門學(xué)科。組織通?？梢苑譃閮煞N類型：主動組織，即能夠產(chǎn)生力的組織（例如骨骼肌、平滑肌和心肌）；被動組織，即被動響應(yīng)生物力的組織（例如韌帶、結(jié)締組織等）。使用生物力學(xué)對組織主動產(chǎn)生或被動響應(yīng)生物力進(jìn)行測量，可以得到對病理和治療效果的客觀、量化的結(jié)果。測量內(nèi)容包括極限載荷、極限伸長率及彈性模量。彈性模量是指應(yīng)力-應(yīng)變曲線線性區(qū)域中應(yīng)力與該方向上應(yīng)變的比。由于組織主動產(chǎn)生或被動響應(yīng)生物力的能力本質(zhì)上與其生化組成有關(guān)，因此對盆底生物力學(xué)的深入了解有助于PFD 的發(fā)病機(jī)制和治療方法的探索。

3.2 生物力學(xué)和SUI生物力學(xué)對于PFD 領(lǐng)域并不是新名詞，尿動力學(xué)參數(shù)如漏尿點(diǎn)壓已經(jīng)用于SUI 的輔助診斷。傳統(tǒng)的動物模型通過動物的癥狀（如脫垂和漏尿的有無和程度）和一些驗(yàn)證方法如打噴嚏實(shí)驗(yàn)等來評估病理和治療效果，只能得到定性而非定量的結(jié)果。生物力學(xué)測量一定程度上突破了這一束縛。人工漏尿點(diǎn)壓測試、傾斜臺漏尿點(diǎn)壓測試及尿道閉合壓測試均可得到客觀的觀測指標(biāo)結(jié)果。Liang 等[39]對盆腔神經(jīng)橫斷術(shù)的大鼠模型移植人羊水干細(xì)胞，使用人工漏尿點(diǎn)壓測試發(fā)現(xiàn)漏尿點(diǎn)壓在盆腔神經(jīng)橫斷術(shù)后降低，在移植人羊水干細(xì)胞后則得到明顯改善。

3.3 生物力學(xué)和POP生物力學(xué)也在POP 中發(fā)揮重要作用。Zhang 等[19]對切除卵巢后的恒河猴模型陰道局部注射間充質(zhì)干細(xì)胞，并測量陰道壁的生物力學(xué)，證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞可以提高陰道壁的硬度。Abramowitch 等[8]開發(fā)了一種研究陰道支持組織復(fù)合體（vaginal support tissue complex，VSTC）的嚙齒動物模型，發(fā)現(xiàn)在妊娠中晚期VSTC 的線性硬度及極限載荷都下降近50%。Clark-Patterson 等[40]對腓骨蛋白5 單倍體缺乏型和進(jìn)行性脫垂型的小鼠進(jìn)行生物力學(xué)測量，發(fā)現(xiàn)兩者的陰道收縮力均降低。然而，生物力學(xué)不應(yīng)局限于某一組織，還應(yīng)擴(kuò)大至整個盆底，但目前尚無能將盆底視為一個整體的生物力學(xué)測量模型。

4 結(jié)語與展望

由于人體試驗(yàn)受到醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的約束，動物實(shí)驗(yàn)成為研究PFD 的有力補(bǔ)充。本綜述系統(tǒng)地總結(jié)了目前動物模型在PFD 不同類型的模型動物及造模方法，發(fā)現(xiàn)嚙齒類動物模型使用最多，非人類靈長類動物最為理想[18]，不同動物模型均有其局限性；模擬分娩是最主要的造模方法，但不能完全復(fù)制人類分娩過程，仍有較大的改善空間?；蚣夹g(shù)可以用于構(gòu)建特定性質(zhì)的動物模型，通過改變動物模型的基因表達(dá)，最終得到與人類更相似的發(fā)病轉(zhuǎn)歸過程，更有利于PFD 的探索研究。尋求“相似性”可能是PFD 動物模型前進(jìn)發(fā)展的一個方向。本綜述還探討了生物力學(xué)在動物模型中的作用。將生物力學(xué)納入動物模型測量體系中，可以得到對病理和療效的客觀、量化的結(jié)果，避免人為的判斷誤差。但目前尚無將整個盆底視為一個整體的生物力學(xué)測量模型，學(xué)者們?nèi)匀狈φ麄€盆底更系統(tǒng)、更全面的了解。尋求“客觀性”和“整體性”可能是PFD 動物模型前進(jìn)發(fā)展的又一方向。