微膠囊的胰島免疫隔離技術(shù)研究進(jìn)展

李珅，張航與，劉波，李欣宇，高政南

（1.大連理工大學(xué)附屬中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 大連 116000；2.大連理工大學(xué)電信學(xué)部生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116024）

胰島移植是治療1 型糖尿病和脆性糖尿病的有效方案之一，但移植后患者需要終身服用免疫抑制劑等缺點(diǎn)，從而限制了胰島移植的開展。為了克服胰島移植的生物障礙，開發(fā)出具有一定治療前景的封裝策略。雖然胰島封裝不需服用免疫抑制劑，但由于長期缺乏胰島素的生成等因素，此類方法限制了胰島封裝的臨床應(yīng)用。近年來，關(guān)于提高微囊化胰島移植效果的研究逐漸增多，多種工程策略用于改善包封和移植后胰島存活成為研究熱點(diǎn)。因此，本文就免疫封裝技術(shù)和新型微膠囊技術(shù)在胰島移植中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，探討微囊化胰島移植存在的問題和潛在的改進(jìn)方法，旨在為微囊化胰島移植治療糖尿病的臨床應(yīng)用提供參考。

近年來，由于飲食習(xí)慣的改變和生存壓力的增大，糖尿病發(fā)病率逐年上升。1 型糖尿病和脆性糖尿病從病理生理角度上可以共同解釋為胰島細(xì)胞衰竭類疾病，該類疾病極大程度危害糖尿病患者的生存狀態(tài)，造成血糖不穩(wěn)，導(dǎo)致頻發(fā)酮癥酸中毒、全身并發(fā)癥加重和低血糖。夜間無癥狀低血糖能夠造成患者心律不齊和低鉀血癥，進(jìn)而促使患者在睡眠中心臟不能正常復(fù)極化最終導(dǎo)致死亡，即臨床中的“Dead in bed”［1］。目前治療這種糖尿病最廣泛接受的臨床方法是注射外源性胰島素［2］。然而，血糖波動控制不良以及伴隨的諸如神經(jīng)病變、腎病、視網(wǎng)膜病變、心臟病和動脈粥樣硬化等并發(fā)癥迫使人們尋找替代治療方法［3］。器官或組織移植可以阻止并發(fā)癥發(fā)生，胰腺移植是一種有效選擇，但胰腺移植供體少、手術(shù)難度大、對患者損傷大且終身需要免疫抑制藥物，因此推廣困難［4］。相對來說，胰島移植的侵入性較小，為外源性胰島素治療提供了一個(gè)有希望的替代方案［5-7］。

胰島移植已被加拿大、澳大利亞以及美國個(gè)別單位批準(zhǔn)為治療1 型糖尿病和脆性糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)方法。但是胰島細(xì)胞移植患者仍需終身使用雷帕霉素為主的免疫抑制劑［8-9］。目前最有潛力解決這些問題的方法是改變組織免疫原性和免疫隔離［10-12］。科學(xué)家開發(fā)了免疫隔離策略以避免在胰島移植中使用免疫抑制劑，下面對免疫隔離問題進(jìn)行綜述。

1 免疫封裝技術(shù)概述

細(xì)胞免疫隔離策略是指使用選擇性滲透膜將移植細(xì)胞或組織與宿主免疫系統(tǒng)分離［13］。這種選擇性滲透膜或其他具有相似功能的封裝材料可以阻止炎性細(xì)胞和大的免疫調(diào)節(jié)分子（例如抗體和細(xì)胞因子）進(jìn)入。免疫隔離技術(shù)可以解決胰島移植臨床應(yīng)用中的2 個(gè)主要障礙，即免疫抑制劑對患者的傷害，同時(shí)擴(kuò)大胰腺供體來源［14-15］。免疫分離的概念可以追溯到1933 年，當(dāng)時(shí)Vincenzo Bisceglie 描述了腫瘤細(xì)胞在聚合物中的成功封裝［16］。封裝是一種免疫隔離技術(shù)，治療細(xì)胞或組織被包裹在選擇性滲透生物材料中以逃避宿主免疫反應(yīng)。一般來說，封裝方法可分為血管內(nèi)封裝、血管外宏封裝、血管外微（微膠囊）封裝和納米封裝（胰島表面涂層）。

1.1 血管內(nèi)封裝：裝直接連接到血液循環(huán)，管內(nèi)封裝可以使胰島與血流緊密接觸，快速交換葡萄糖和胰島素，因此可以快速控制血糖水平。這種封裝方法會帶來一些風(fēng)險(xiǎn)，例如靜脈吻合處的血栓形成、感染和原發(fā)性或繼發(fā)性內(nèi)膜增生等。

1.2 宏封裝：宏封裝或微封裝的分類取決于膠囊中封裝胰島的數(shù)量，宏封裝指將大量胰島封裝在一起，血宏封裝體中胰島易聚集成大團(tuán)塊，導(dǎo)致核心壞死，營養(yǎng)和氣體擴(kuò)散有限，而且封裝結(jié)構(gòu)薄弱，在植入過程中容易破裂［17］。此外，這種封裝的一個(gè)固有缺點(diǎn)是宏封裝體的比表面積較小，不利于物質(zhì)擴(kuò)散。

1.3 納米封裝：納米封裝或保形涂層是一種新興的封裝技術(shù)，通過界面聚合在胰島表面形成一層水凝膠薄膜［18-19］。納米封裝的主要限制是臨床應(yīng)用的困難。這種方法無法控制單個(gè)納米封裝胰島的位置，因此難以取回或移除移植的胰島［20］。而且納米封裝過程中部分涂層可能不完整而使胰島暴露，進(jìn)而觸發(fā)宿主的免疫反應(yīng)［21］。不僅如此，納米封裝過程中常使用有毒化學(xué)試劑和紫外線，可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性而影響胰島活性［22-23］。

1.4 微封裝：微封裝是指將少數(shù)單個(gè)胰島 （通常＜3 個(gè)）封裝在選擇性滲透的微球中。微封裝可能是糖尿病患者胰島移植的首選方法，因?yàn)槲⒛z囊提供了較大的比表面積，有助于快速交換營養(yǎng)物質(zhì)和激素［24］。微囊化的原理是使用合適的聚合物將單個(gè)胰島包裹成微膠囊。用于微膠囊化的聚合物不應(yīng)影響內(nèi)部的細(xì)胞和組織的活力和功能。此外，它既要足夠柔軟以適應(yīng)體內(nèi)軟組織環(huán)境，還要足夠強(qiáng)韌以避免破裂，同時(shí)還要允許營養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散到膠囊中，治療性激素（胰島素）從膠囊中擴(kuò)散出來。由于水凝膠的柔性和可調(diào)性，包括海藻酸鹽、瓊脂糖、聚乙二醇、丙烯腈共聚物和殼聚糖在內(nèi)的多種水凝膠已被用于開發(fā)微膠囊封裝技術(shù)［25］。截至目前，最理想的微膠囊封裝材料是海藻酸鹽，它的水溶液在與二價(jià)陽離子交聯(lián)時(shí)發(fā)生凝膠化，進(jìn)而形成剛性微球。海藻酸鹽水凝膠的孔隙率和機(jī)械性能在一定范圍內(nèi)可調(diào)控，主要取決于海藻酸鹽多糖鏈中2 種單元的比例、海藻酸鹽的濃度、二價(jià)陽離子的選擇和濃度［26］。

1.4.1 微封裝發(fā)展的過程：最初的微膠囊封裝技術(shù)是將含有胰島的藻酸鹽溶液擠出成液滴，進(jìn)入含有二價(jià)陽離子交聯(lián)劑（氯化鈣）的溶液發(fā)生交聯(lián)形成水凝膠微膠囊［27］。在之后的研究中，這種微膠囊化技術(shù)不斷改進(jìn)以獲得胰島微膠囊的所需特性，例如調(diào)整針頭尺寸，采用同軸氣流或電場提供剪切力，調(diào)控溶液流速和氣流壓力等［28-30］。目前，微流控技術(shù)已被用于微膠囊封裝胰島，這項(xiàng)技術(shù)有利于高通量生成尺寸均一的微膠囊［31-32］。海藻酸鹽微膠囊的免疫隔離性能取決于用于微膠囊化的海藻酸鹽水凝膠的分子滲透性，而后者又取決于水凝膠本身的孔隙特征和所涉及分子的生物化學(xué)特征，例如分子的大小、形狀、分子量和帶電基團(tuán)等。海藻酸鹽水凝膠的孔徑范圍為5 ～ 200 nm，由前述的4 個(gè)參數(shù)所決定［33］。這種孔徑范圍一般允許小于650 kDa 的分子通過，包括氧氣、二氧化碳、尿素、葡萄糖、胰島素和其他大分子。不同研究報(bào)道的截留分子量有較大差別，因此，海藻酸鹽水凝膠的孔隙率需要適當(dāng)調(diào)整以實(shí)現(xiàn)免疫隔離［34-35］。

1.4.2 微封裝半透膜的選擇：聚陽離子如聚-L-賴氨酸或殼聚糖作為性質(zhì)不同的另一種半透膜包被海藻酸鹽水凝膠微膠囊可為封裝細(xì)胞提供免疫隔離［36-39］。為了避免聚陽離子涂層引起免疫反應(yīng)，需要在其外面再包被第二層海藻酸鹽，由此構(gòu)成海藻酸鹽-PLL/PLO-海藻酸鹽微膠囊。盡管迄今為止的臨床前大型動物模型研究和臨床試驗(yàn)都顯示了封裝胰島具有正常功能，但其長期存活率和功能仍存在問題［24，40-42］。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)研究和評估了近35 年，但市場上還沒有任何相關(guān)的臨床治療產(chǎn)品。微膠囊封裝技術(shù)在臨床上面臨的主要問題是胰島功能的改變和宿主的免疫反應(yīng)。

1.4.3 微封裝存在的問題：移植的封裝胰島受到聚合物的保護(hù)可以免受宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，然而目前常用的封裝材料本身卻成為宿主免疫系統(tǒng)的目標(biāo)。實(shí)際上異物反應(yīng)發(fā)生在幾乎所有常用的植入材料上，纖維化組織會沉積在植入物上形成致密的無血管膠原層。這層纖維化囊會影響氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)等的擴(kuò)散，危及封裝胰島的存活，同時(shí)也會阻礙植入物實(shí)現(xiàn)治療功能的葡萄糖/胰島素運(yùn)輸。而且材料表面吸附蛋白，還會引發(fā)免疫反應(yīng)、補(bǔ)體激活等嚴(yán)重的生物反應(yīng)。而對于目前封裝胰島最常用的海藻酸鹽材料，其微膠囊內(nèi)鈣鹽的不斷積累和沉淀也會導(dǎo)致微膠囊內(nèi)胰島細(xì)胞失去功能［38］。另外，生理環(huán)境中大量存在的單價(jià)陽離子（如鈉離子）不可避免的會置換作為交聯(lián)劑的鈣離子而導(dǎo)致微膠囊溶脹，使微膠囊封裝結(jié)構(gòu)失效。綜上，開發(fā)免疫隔離效應(yīng)高，供氧充足，免疫原性低的微膠囊依然任重道遠(yuǎn)。

2 新型微膠囊技術(shù)

2.1 微囊化胰島、網(wǎng)袋結(jié)合的胰島移植新方法：微囊化胰島移植作為一種有前景的治療1 型糖尿病的方法被廣泛研究。微囊化胰島移植部位的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致胰島早期功能障礙，移植部位周圍缺乏血管導(dǎo)致營養(yǎng)不良和缺氧，難以切除胰島。研究人員提出了一種將間充質(zhì)干細(xì)胞與重組肽片、微囊化胰島和網(wǎng)袋相結(jié)合的新型胰島移植方法，該技術(shù)通過細(xì)胞網(wǎng)袋形式增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的血管誘導(dǎo)效應(yīng)，并通過共移植增強(qiáng)胰島移植的效果。研究通過結(jié)合微囊化的胰島、MSC-細(xì)胞網(wǎng)袋和包覆它們并使其能夠去除的網(wǎng)袋，對糖尿病小鼠進(jìn)行胰島移植，治療血糖效果顯著增加。間充質(zhì)干細(xì)胞與重組肽片、微囊化胰島和網(wǎng)袋相結(jié)合的新型胰島移植技術(shù)可以增強(qiáng)胰島移植的效果［43］。

2.2 微膠囊內(nèi)血管化研究新進(jìn)展：目前臨床胰島移植的療效受到長期移植功能障礙和損耗的限制，血管化是解決途徑之一。Mao 等［44］探究絲質(zhì)纖維素大孔（SF）支架在糖尿病小鼠中進(jìn)行同種異體胰島移植的血管化的潛力。該研究使用含有肝素的SF 支架（H-SF），在糖尿病小鼠的附睪脂肪墊中與H-SF 或SF 支架共同移植胰島。結(jié)果表明H-SF-胰島聯(lián)合移植導(dǎo)致高血糖的更快逆轉(zhuǎn)糖尿病，葡萄糖反應(yīng)性完全正?；L期血糖水平更低。移植結(jié)果顯示H-SF 促進(jìn)的胰島血管重塑和細(xì)胞增殖，因?yàn)閺腍-SF-胰島聯(lián)合移植小鼠的移植物中顯示出胰島內(nèi)分泌和內(nèi)皮細(xì)胞增殖明顯增加，伴隨著血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的上調(diào)，小鼠出現(xiàn)明顯的血管重塑。此外，當(dāng)H-SF 與從VEGFR2-LUC 轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)提取的胰島共同移植時(shí)，收集到與VEGFR2 表達(dá)相對應(yīng)的生物發(fā)光信號的持續(xù)升高，這意味著肝素依賴性激活內(nèi)源性VEGF/VEGFR2 途徑在促進(jìn)小鼠血管重塑和增殖中的作用［44］。Bowers 等［45］用聚3-羥基丁酸-co-3-羥基戊酸與聚己內(nèi)酯混合以獲得機(jī)械穩(wěn)定性并電紡成納米纖維，移植2 周后局部釋放鞘氨醇-1-磷酸受體激活信號小分子FTY720 能夠協(xié)調(diào)局部的再生環(huán)境，具有免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)血管生成的作用。

2.3 微膠囊免疫排斥降低方式新進(jìn)展：細(xì)胞外基質(zhì)的不斷優(yōu)化和微囊膜涂層的不斷優(yōu)化，是研究者們不斷優(yōu)化微囊免疫排斥的新途徑。Chaimov 等［46］利用豬胰腺的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）制造微膠囊，將液化后的ECM 與海藻酸鹽結(jié)合，膠囊涂覆聚L-賴氨酸。結(jié)果顯示，ECM 包裹的細(xì)胞被證明是無免疫原性的，最重要的是，它能顯著改善糖尿病小鼠臨床前模型的血糖控制，從而為這種新的基于細(xì)胞的胰島素輸送平臺建立了概念驗(yàn)證［45］。Fukuda 等［47］建立了一種細(xì)胞涂層技術(shù)，使細(xì)胞表面能夠被逐層（layer-by-layer，LbL）組裝的細(xì)胞外基質(zhì)所覆蓋。LbL 涂層的細(xì)胞可以構(gòu)建結(jié)構(gòu)良好、密度大的球狀體。功能分析表明，與無涂層細(xì)胞的球狀體相比，有LbL 涂層細(xì)胞的球狀體具有更強(qiáng)的胰島素分泌能力，胰島素和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2 基因的表達(dá)增加，縫隙連接分子connexin 36 的表達(dá)上調(diào)，葡萄糖敏感性明顯改善。這種細(xì)胞涂層技術(shù)為制造胰腺β 細(xì)胞球狀體提供了一種新的優(yōu)化選擇［46］。

2.4 擴(kuò)大生成規(guī)模新研究：生物治療的均質(zhì)性是微囊化移植的成功因素之一，可以減少細(xì)胞抗原的暴露，均衡減少免疫反應(yīng)，保證胰島封裝率。由于在微流控設(shè)備上可進(jìn)行無限制的設(shè)計(jì)，因此有無數(shù)種方法來優(yōu)化封裝過程。近期被廣泛研究的方向之一是擴(kuò)大膠囊生產(chǎn)。一項(xiàng)研究表明，有8 個(gè)出口的微流控裝置與其他方法相比，胰島包封率更高［47］。在臨床試驗(yàn)中，人類的移植每公斤體重大約需要10000 個(gè)IEQs，胰島的封裝率對維持胰島的生存能力也至關(guān)重要。當(dāng)胰島被封裝時(shí)，已經(jīng)封裝的胰島必須在等待時(shí)間內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)或保存，這個(gè)過程不便于臨床實(shí)施并且可能導(dǎo)致胰島死亡。使用微流控的方法可以在更短的時(shí)間內(nèi)增加封裝的胰島的數(shù)量，以便擴(kuò)大規(guī)模，同時(shí)還可以不增加胰島的流速或剪切應(yīng)力。Onoe 等［48］利用雙同軸微流控系統(tǒng)，將大鼠胰島封裝在由胰島膠原核和藻酸瓊脂糖殼制成的核心-殼水凝膠微纖維中。用微導(dǎo)管植入糖尿病小鼠的腎囊空間，結(jié)果顯示移植后的大鼠血糖正常超過36 d。

3 微囊化胰島移植的展望

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是我國發(fā)病率較高的慢性進(jìn)展性疾病，胰島移植可有效治療糖尿?。?9-51］。胰島的封裝在過去的幾十年里有了很大的進(jìn)步。但胰島移植要想成為一種可行的治療標(biāo)準(zhǔn)，就必須提供長期的治療效果。雖然微囊化胰島還在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但多年來還沒有一項(xiàng)試驗(yàn)顯示患者的血糖水平得到了良好的控制。減輕移植后缺氧的方法也可以用來減少細(xì)胞死亡，血管化可以減少細(xì)胞死亡，增加血漿胰島素濃度。研究人員需要繼續(xù)致力于改進(jìn)包封技術(shù)，以減少免疫反應(yīng)和提高細(xì)胞活力。不斷尋找制備優(yōu)質(zhì)材料改進(jìn)胰島移植的效率，另外，如果胰島可以大規(guī)模生產(chǎn)和封裝，胰島移植的成本將會減少，以上因素的不斷優(yōu)化將有望使微囊化移植成為糖尿病患者安全、有效、經(jīng)濟(jì)的治療方法。