LRRK2的功能及其在神經(jīng)變性疾病中的作用機制

張秋陽，蔣小玲，程云帆，潘曉東

富亮氨酸重復序列激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)基因位于染色體12p11.2-q13.1，其所編碼的LRRK2蛋白，屬于ROCO超家族，是由2 527個氨基酸組成的大分子蛋白。最新發(fā)現(xiàn)LRRK2可以作為神經(jīng)囊泡運輸、免疫及炎癥的主要調節(jié)劑，其突變在引起帕金森病(Parkinson's disease，PD)、路易體癡呆、麻風病、克羅恩病等中樞和外周免疫相關疾病中具有重要作用[1]。迄今為止，在PD研究領域，LRRK2基因仍是研究的熱點。除PD外，近年來的遺傳學研究表明，LRRK2突變與阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的病理改變及發(fā)生風險密切相關，本文將對此展開綜述。

1 LRRK2的結構及介導的信號通路

LRRK2基因也稱為Park8 基因，是一種大小為280 KDa的多區(qū)域多功能、廣泛表達的大分子蛋白[1]。其復雜的結構域和廣泛的表達，預示著其復雜的細胞功能和活動。LRRK2通過ROC-COR結構域賦予GTPase活性和絲氨酸-蘇氨酸激酶兩種不同酶活性的結構域，嵌入ARM、ANK、LRR及WD40 4個蛋白相互作用的結構域中[1]。在LRRK2的兩種酶活性中，大部分功能都集中在激酶活性上。最常見的致病變異體G2019S突變會導致其激酶活性升高[2]。由此猜想，所有致病突變可能通過底物蛋白的過度磷酸化而導致疾病的病理狀態(tài)。此機制促進了開發(fā)LRRK2激酶抑制劑的可能性。

LRRK2介導的信號通路包括生長因子、存活、死亡受體和Wnt信號通路[3-4]。到目前為止，LRRK2的上游調控是通過結構性活性激酶GSK3β和CK1α的異磷酸化進行的。這些激酶以及PKA會磷酸化ANK和LRR重復序列之間的殘基，而磷酸酶PP1會介導磷酸化位點的去磷酸化，從而影響與14-3-3蛋白的相互作用。反過來，這種異磷酸化是與14-3-3蛋白相互作用所必需的，對LRRK2的亞細胞定位具有重要意義[5]。有研究發(fā)現(xiàn)Rab蛋白是最成熟的LRRK2激酶底物。Rab29已被確定為LRRK2的上游GTPase，它將GTP結合的LRRK2招募到反式高爾基體中，從而增強LRRK2 S1292的自動磷酸化，并可能增加LRRK2的異磷酸化，同時刺激高爾基體衍生的囊泡清除[6]。這表明LRRK2在Rab蛋白的下游和上游，特別是Rab29的下游和Rab8a、Rab10及Rab29的上游分別存在一個信號環(huán)。根據(jù)LRRK2作為信號支架的角色，這種在反式高爾基體的復雜相互作用很可能發(fā)生在多蛋白信號轉導復合物中。

2 LRRK2的定位與表達

LRRK2主要存在于細胞質中[7]。LRRK2富含于脂筏、早期內(nèi)小體、溶酶體、突觸小泡及質膜，也存在于高爾基復合體、內(nèi)質網(wǎng)和線粒體外膜[8]。此外，LRRK2也與內(nèi)化的表皮生長因子存在共定位，表明相當一部分蛋白質存在于內(nèi)體系統(tǒng)膜上。LRRK2在幾種膜結構中的豐富表達，提示了LRRK2在膜轉運中的作用。同時LRRK2還與網(wǎng)格蛋白輕鏈(CLC)存在部分共定位，這可能反映了LRRK2在蛋白質降解過程中參與多泡小體形成的早期內(nèi)體(EEA1)的雙層網(wǎng)格蛋白涂層[9]。因此，CLC可能作為一種支架將LRRK2募集到早期內(nèi)體的雙層網(wǎng)格蛋白涂層上。有研究提示，在高表達LRRK2的不同細胞類型中經(jīng)氯喹處理后，LRRK2被募集到擴大的溶酶體上并激活，其上游接頭Rab29促進LRRK2在溶酶體上的募集[10]。LRRK2與幾種細胞骨架、轉運相關蛋白及RabGTPase家族的相互作用進一步支持了LRRK2在蛋白降解途徑中的作用[11-12]。

LRRK2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也有表達。小膠質細胞是大腦的常駐免疫細胞，關于LRRK2是否在小膠質細胞中表達目前報道并不一致。通過人類和小鼠純化的腦細胞分類群體的轉錄分析表明，在星形膠質細胞和神經(jīng)元中可以檢測到LRRK2轉錄本，而在小膠質細胞中的檢測率明顯減少[13]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，在人類的小膠質細胞、成年小鼠以及來自幼鼠的原代小膠質細胞檢測到大量的LRRK2 mRNA和蛋白表達[14-16]。造成上述結果差異的機制尚不明確，很可能是由于在固定的腦組織中使用LRRK2抗體的特異性和重復性問題，另一種可能是難以準確分離小膠質細胞從而導致研究結論產(chǎn)生差異。

3 LRRK2的生理功能

LRRK2涉及細胞系統(tǒng)的多個功能，如細胞遷移、自噬、吞噬作用及炎性細胞因子產(chǎn)生調控[17-18]。在小鼠原代小膠質細胞中，R1441G突變導致脂多糖(LPS)驅動的炎性細胞因子釋放增加[15]，而敲除LRRK2基因的表達具有相反的作用[19]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，LRRK2G2019S突變的中老年小鼠的皮層、紋狀體腦區(qū)中的炎性細胞因子及其補體的表達水平較高[20]，表明LRRK2基因突變在中樞免疫細胞具有病理作用。

LRRK2也與細胞自噬有關。自噬的降解途徑在調節(jié)先天免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)的不同方面起著至關重要的作用，并且由于這兩條途徑在溶酶體上的匯聚而與吞噬作用有內(nèi)在的聯(lián)系。有研究表明，LPS刺激單核細胞系增加了LRRK2向自噬體膜的募集，LRRK2基因的敲除導致自噬缺陷[21]。此外，在小鼠巨噬細胞系中發(fā)現(xiàn)，當溶酶體超負荷應激時，LRRK2與RAB7L1一起被招募到溶酶體，在溶酶體中，LRRK2通過磷酸化使Rab8和Rab10特異性地穩(wěn)定在過載的溶酶體上[10]。同一研究發(fā)現(xiàn)，LRRK2基因敲除增加了空泡化和脂褐素的自發(fā)熒光，表明LRRK2可能在溶酶體應激時，防止溶酶體擴大和上調溶酶體的分泌。

4 LRRK2突變與PD

LRRK2基因的顯性遺傳突變可能是家族性和散發(fā)性PD最常見的原因，已在大約3%～5%的家族性和1%～3%的散發(fā)性PD病例中發(fā)現(xiàn)，不同人群的發(fā)病率可能有很大差異。目前的研究發(fā)現(xiàn)G2019S和R1441C是最常見的兩種突變，在某些人群中占遺傳性PD病例的30%，在散發(fā)型PD病例中分別占10%和2.5%[22]。LRRK2的病理功能主要與異常的激酶活性有關。一般來說，LRRK2致病突變體的高激酶活性與PD的一系列神經(jīng)病理特征相關，包括α突觸核蛋白異常沉積、磷酸化Tau蛋白的積累、TDP-43的聚集、多巴胺能神經(jīng)元死亡、多巴胺神經(jīng)遞質傳遞和活性受損、炎癥反應及氧化損傷等[23]。最近有研究對臺灣人群的LRRK2基因測序發(fā)現(xiàn)，LRRK2G2385R變異在PD患者中的發(fā)生率是正常人的兩倍，證實LRRK2G2385R突變是亞洲人群的風險因素[24]。該突變位于WD40的C末端區(qū)域，可能改變蛋白質結構并調節(jié)LRRK2與囊泡運輸相關的相互作用因子的結合。有趣的是，LRRK2R1398H已被確定可通過降低蛋白活性來預防PD[25]。罕見的LRRK2編碼變異與較早的疾病發(fā)病年齡有關[26]?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明，LRRK2基因的編碼和非編碼變異與PD發(fā)生有很強的聯(lián)系，其可影響發(fā)病年齡及外顯率，并導致PD發(fā)病的易感性和保護性。

5 LRRK2突變與AD

盡管LRRK2突變并不常見于AD，但研究顯示LRRK2突變與AD病理改變明顯關聯(lián)[27]。Tau蛋白過度磷酸化是AD患者的普遍病理特征。磷酸化形式的Tau從微管蛋白解離并自聚集形成神經(jīng)內(nèi)纏結，這與神經(jīng)元毒性和AD病理有關[23]。先前的研究表明，致病突變體LRRK2G2019S和I2020T可直接在Thr181位點磷酸化Tau蛋白，引起Tau蛋白過度磷酸化[28]。引起Tau 蛋白過度磷酸化的有 GSK3β、MAPKs及CDK5 蛋白激酶，抑制 Tau 磷酸化的有 PP2A及PP2B等去磷酸化酶。LRRK2可以通過磷酸化激活GSK3β，調節(jié)p38MAPK使 Tau 過度磷酸化[29-30]。另一方面，淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)在AD發(fā)病機制中具有重要作用。有研究表明，AD患者的大腦中存在APP的磷酸化，其與淀粉樣蛋白沉積的產(chǎn)生相關。有證據(jù)表明APP胞內(nèi)結構域(APP intracellular domain，AICD)在APP相關疾病(如AD)中可能產(chǎn)生作用。APP Thr668位點的磷酸化可促進AICD的產(chǎn)生和轉錄活性。LRRK2與APP在其胞內(nèi)結構域的Thr668位點相互作用并磷酸化。有研究發(fā)現(xiàn)，LRRK2G2019S突變致患者死后腦組織和多巴胺能神經(jīng)元中Thr668處磷酸化APP的數(shù)量明顯高于健康人。而LRRK2抑制劑可降低患者來源的多巴胺能神經(jīng)元和LRRK2G2019S小鼠中腦Thr668位點APP的磷酸化。由此可見，APP是LRRK2的底物，LRRK2可能通過影響APP磷酸化和AICD功能參與AD的發(fā)病機制[31]。

此外，LRRK2某些基因位點突變也與AD發(fā)生風險關聯(lián)。亞洲人群最常見的LRRK2R1628P突變可減輕AD發(fā)生風險[32]，R1628P突變可導致LRRK2激酶功能減低，提示LRRK2缺失可能在AD中具有保護作用。最近，有研究對75個中國AD家庭非攜帶性癡呆基因致病突變的先證者進行了277個神經(jīng)退行性相關基因的靶向測序，發(fā)現(xiàn)LRRK2I2012T突變在早發(fā)性阿爾茨海默病(early onset Alzheimer’s disease，EOAD)家庭中被發(fā)現(xiàn)[33]。這些發(fā)現(xiàn)提供了LRRK2基因變異可能與AD易感性有關的證據(jù)。

6 LRRK2的臨床意義

LRRK2是一種大而復雜的蛋白，在疾病的病理生理過程中起著重要作用，其GTPase和激酶結構域的突變與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。LRRK2突變及功能異常促進α突觸核蛋白異常沉積、Tau病理、炎性反應、突觸功能障礙及自噬溶酶體機能異常[20，34-35]，這些病理生理改變在AD、PD及路易體癡呆(dementia with Lewy bodies,DLB)等神經(jīng)變性疾病中共同存在。這些發(fā)現(xiàn)強烈提示LRRK2可能成為干預AD、PD等神經(jīng)變性疾病的潛在有價值的藥理靶點。

LRRK2 某些位點突變(如G2019S、R1441C)可引起LRRK2酶活性異常增高和功能異常[2,36]，從而引起神經(jīng)毒性。針對LRRK2酶活性的治療可能成為神經(jīng)變性疾病的一種治療手段。部分研究者致力于開發(fā)臨床適用的小分子LRRK2激酶抑制劑。目前，LRRK2激酶抑制劑的開發(fā)取得了顯著進展。最近DNL201LRRK2激酶抑制劑進入了健康志愿者的Ⅰa期臨床試驗。盡管尚不清楚其潛在的長期副作用，但現(xiàn)有的結果顯示志愿者可以耐受急性LRRK2抑制作用，因此有希望在未來進入臨床使用[37]。

盡管LRRK2激酶抑制劑的開發(fā)和使用在基礎研究領域取得了令人鼓舞的進展，但其確切的LRRK2生物學功能及藥理抑制作用目前尚不清楚。越來越多的證據(jù)表明，遺傳基因效應和外周免疫之間的相互作用改變了神經(jīng)變性疾病發(fā)病風險。LRRK2激酶抑制劑的抗炎特性可能通過下調小膠質細胞或外周免疫來改變疾病病理進展，在早期延緩LRRK2突變風險攜帶者高炎癥水平的發(fā)病時間[38]。

最后，值得注意的是，針對LRRK2的治療方法除了小分子激酶抑制劑之外，有研究報道LRRK2反義寡核苷酸(LRRK2ASO)可以降低臨床前疾病模型大腦中LRRK2的表達水平[39]。LRRK2ASO治療的安全性和耐受性的Ⅰ期試驗(BIIB094)也已證明了其療效和安全性。鞘內(nèi)注射ASO，可以避免干擾外周的LRRK2表達。設計獨特的LRRK2特定突變體和(或)針對不同組織(細胞群)的靶向療法可能是有益的。但仍然需要進一步了解LRRK2在免疫系統(tǒng)中的作用及LRRK2相關激酶調節(jié)炎癥性疾病的機制，才能有效地在神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中優(yōu)化使用靶向LRRK2制劑，改善神經(jīng)變性疾病的癥狀及病理損害，從而延緩疾病進程。