脈沖電場(chǎng)消融與細(xì)胞電穿孔:從基礎(chǔ)到臨床

徐劍剛 唐閩 梁明 儲(chǔ)慧民 張勁林 程佳麗 王永勝 王祖祿

近年來(lái),應(yīng)用脈沖電場(chǎng)消融(pulsed field ablation,PFA)心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱房顫)在國(guó)內(nèi)外得到了較快的開(kāi)展,多項(xiàng)基于PFA 技術(shù)的多中心、大樣本臨床研究正在推進(jìn)中。筆者回顧PFA 相關(guān)的基礎(chǔ)和臨床研究,系統(tǒng)闡述細(xì)胞膜穿孔的形成過(guò)程,再密封過(guò)程,以及不同脈沖參數(shù)等對(duì)消融損傷的影響,期望幫助讀者全面了解PFA 技術(shù),從而在臨床上更好地應(yīng)用該技術(shù)。

1 PFA概述

PFA 是指在非常短的時(shí)間內(nèi)(ms、μs、ns)應(yīng)用間歇性的高強(qiáng)度脈沖電場(chǎng)造成細(xì)胞膜電穿孔和細(xì)胞死亡/凋亡[1],從而喪失生物學(xué)功能。按照電穿孔的程度又可分為可逆性電穿孔(reversible electroporation,RE)和不可逆性電穿孔(irreversible electroporation,IRE)。RE細(xì)胞保持完整,仍然有活性,該技術(shù)主要用于基因工程,藥物篩選和電化學(xué)治療領(lǐng)域。IRE細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整,細(xì)胞凋亡,主要應(yīng)用在實(shí)體腫瘤和心律失常消融方面。

2. 脈沖電場(chǎng)技術(shù)的發(fā)展史

脈沖電場(chǎng)技術(shù)始于上世紀(jì)六十年代食品和水消毒領(lǐng)域。八十年代初,Scheinman等[2]嘗試應(yīng)用直流電脈沖消融心動(dòng)過(guò)速,那是脈沖技術(shù)首次用于心臟領(lǐng)域,由于當(dāng)時(shí)對(duì)電脈沖的認(rèn)識(shí)不足,安全性無(wú)法保證而終止。Neumann 等[3]在1982年首先應(yīng)用電穿孔技術(shù)將外生的DNA 引入到小鼠的淋巴瘤細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞膜在一定強(qiáng)度的脈沖電場(chǎng)中可以發(fā)生RE,這一現(xiàn)象隨后被廣泛應(yīng)用于基因工程,藥物篩選和電化學(xué)治療。本世紀(jì)初,Davalos等[4]應(yīng)用脈沖電場(chǎng)成功地破壞了實(shí)體腫瘤組織。2012年,美國(guó)FDA 批準(zhǔn)基于高頻脈沖電場(chǎng)的納米刀技術(shù)用于腫瘤治療。同年,Fred等[5]首次應(yīng)用脈沖電場(chǎng)技術(shù)和環(huán)形電極對(duì)豬的心外膜心肌組織進(jìn)行消融,驗(yàn)證了脈沖電場(chǎng)在心肌組織內(nèi)可以形成連續(xù)的損傷,脈沖電場(chǎng)造成的損傷深度,足可以實(shí)現(xiàn)肺靜脈的隔離。2018年,Reddy等[6]首次在房顫患者中應(yīng)用PFA 技術(shù)進(jìn)行了肺靜脈消融,15例心內(nèi)膜消融患者即刻成功率100%,每位患者總的PFA 時(shí)間＜60 s,無(wú)嚴(yán)重并發(fā)癥。此后,Reddy等[7]又報(bào)道了81例陣發(fā)性房顫患者,每位患者PFA 肺靜脈時(shí)間≤3 min,隨訪1年無(wú)房性心律失常比例達(dá)87.4%±5.6%?；谶@些較為正向的研究結(jié)果,國(guó)內(nèi)外多家公司正在申請(qǐng)或已經(jīng)開(kāi)展了基于PFA技術(shù)消融房顫的大樣本,多中心的臨床研究。

3 細(xì)胞膜穿孔的形成和再密封過(guò)程

PFA 的核心是細(xì)胞膜的電穿孔。在脈沖電場(chǎng)中,細(xì)胞膜穿孔形成,當(dāng)脈沖電場(chǎng)消失后,細(xì)胞膜即開(kāi)始穿孔的再密封進(jìn)程。因此,了解細(xì)胞膜電穿孔的整個(gè)過(guò)程將有助于更好地理解PFA 和優(yōu)化消融參數(shù)設(shè)置。

3.1 細(xì)胞膜穿孔的形成 當(dāng)細(xì)胞暴露在足夠強(qiáng)的電場(chǎng)中時(shí),膜會(huì)被電擊穿,從而使其對(duì)原本無(wú)法穿過(guò)的分子具有滲透性,使膜具有滲透性的過(guò)程稱為膜電穿孔[8]。膜穿孔主要取決于電場(chǎng)強(qiáng)度和細(xì)胞膜的屬性,穿孔的孔徑通常從數(shù)納米到數(shù)百納米不等,常規(guī)光學(xué)顯微鏡無(wú)法觀測(cè)到。從脈沖電場(chǎng)發(fā)放到膜穿孔發(fā)生通常只有數(shù)百皮秒(picosecond,ps)到數(shù)十納秒(nanosecond,ns)[9]。

電穿孔的形成主要有三個(gè)階段[8]:初始階段、形成階段和成熟階段。初始階段細(xì)胞膜是保持完整的狀態(tài)。形成階段又分為兩個(gè)階段,第一階段是在膜上形成親水孔,這時(shí)的脂質(zhì)雙分子層只是形成了裂孔,但脂質(zhì)分子極性端仍然朝向細(xì)胞膜內(nèi)外的方向。第二階段是穿孔部位的脂質(zhì)分子發(fā)生了位移,極性頭端朝向親水孔,使得整個(gè)孔道變得更親水。成熟階段是穿孔部位的脂質(zhì)分子更加緊密,或與周圍的膜蛋白結(jié)合,使得穿孔的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固。

膜蛋白在穿孔過(guò)程中也發(fā)揮了重要的作用,尤其是電壓門(mén)控的膜離子通道蛋白。穿孔的膜蛋白結(jié)構(gòu)與周邊的親水孔,形成復(fù)合孔,這種復(fù)合孔更水合,更有利于離子的進(jìn)入[10]。

3.2 膜穿孔后的再密封 電場(chǎng)消失數(shù)納秒鐘后再密封即開(kāi)始啟動(dòng),重新封閉成穩(wěn)態(tài)膜結(jié)構(gòu)持續(xù)可達(dá)數(shù)秒鐘,甚至數(shù)小時(shí)。再密封的過(guò)程也分為三個(gè)階段,孔隙密封早期主要是孔隙失穩(wěn),朝向孔道的磷脂親水頭端磷連接的降解,同時(shí)伴有孔徑的縮小。第二階段是孔隙解構(gòu),在孔隙解構(gòu)結(jié)束時(shí),只剩下水柱孔隙。第三階段是水柱孔隙的溶解,膜恢復(fù)到正常狀態(tài)[9]。

膜穿孔后的再密封時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于穿孔形成的時(shí)間,這點(diǎn)在PFA 消融心肌組織的臨床實(shí)踐有重要的指導(dǎo)意義。在Reddy等[7]報(bào)道中,81 例患者共采用了4 種不同的脈沖能量,每個(gè)能量下的即刻隔離成功率均為100%,但在隨訪3個(gè)月后,不同能量下肺靜脈隔離的持久度卻有較大的差異,這提示PFA 后即刻電位消失并不能說(shuō)明消融部位的組織細(xì)胞都形成了持久的IRE,可能有部分心肌細(xì)胞膜為RE,只是膜仍然處于再密封過(guò)程。這也提示在臨床PFA 后,最好要有一段時(shí)間的觀察期,以及早發(fā)現(xiàn)傳導(dǎo)恢復(fù)。

4 影響PFA的因素

脈沖電場(chǎng)的場(chǎng)強(qiáng)和脈沖持續(xù)時(shí)間是決定PFA 效果最重要的兩個(gè)因素,此外,細(xì)胞膜的屬性、細(xì)胞軸向與電場(chǎng)的軸向也會(huì)影響到消融效果[1]。

脈沖電場(chǎng)的場(chǎng)強(qiáng)又受多重因素影響,如脈沖波的參數(shù)(輸出電壓,脈寬等);消融導(dǎo)管的設(shè)計(jì)(電極大小,數(shù)量,間距,組織貼靠)等[1]。場(chǎng)強(qiáng)隨著距離增大而衰減,場(chǎng)強(qiáng)的大小和范圍決定了消融的深度和范圍。在一定場(chǎng)強(qiáng)范圍內(nèi),場(chǎng)強(qiáng)越大,細(xì)胞膜上的穿孔數(shù)量越多,細(xì)胞膜的開(kāi)孔時(shí)間縮短,穿孔的孔徑增大,區(qū)域內(nèi)存活細(xì)胞數(shù)量減少[11]。

4.1 脈沖波的參數(shù) 脈沖波的參數(shù)包括:脈沖輸出電壓(V),脈沖的寬度或持續(xù)時(shí)間,脈沖形狀(單向還是雙向)等。

電壓值是影響場(chǎng)強(qiáng)的最重要的因素之一[9]。不同細(xì)胞的膜穿孔閾值是不同的,輸出的電壓值低于膜的穿孔閾值時(shí),電穿孔現(xiàn)象不會(huì)發(fā)生?？酌芏葘⒆裱妷禾荻?在電極極化端(面向電極)最高。Zager等[13]應(yīng)用脈沖電場(chǎng)對(duì)大鼠的心肌進(jìn)行消融,在其它脈沖參數(shù)相同的情況下,輸出電壓較大組左室射血分?jǐn)?shù)有顯著下降。

脈沖波的寬度也是影響穿孔效果或消融效果的重要因素。在輸出電壓超過(guò)膜的穿孔閾值后,隨著脈寬的增加,跨膜Ca2＋內(nèi)流明顯增加了,提示穿孔效果加強(qiáng)了。在對(duì)多種不同細(xì)胞的脈沖消融存活實(shí)驗(yàn)中,脈寬寬的組別中細(xì)胞存活率均明顯下降[14]。

脈沖波的輸出有單向和雙向兩種形式,通常單向脈沖波的波寬要高于雙向脈沖波。在輸出電壓和總消融時(shí)間相同的情況下,單向脈沖波的穿孔效果明顯優(yōu)于雙向脈沖波[11]。但雙向高頻脈沖波可以通過(guò)提高電場(chǎng)強(qiáng)度,達(dá)到與單向低頻脈沖波同樣的損傷效果[11,14]。單向脈沖波的致穿孔性強(qiáng),引起骨骼肌收縮也明顯強(qiáng)于雙向脈沖波。

除以上因素外,脈沖波的數(shù)量也是影響消融效果的因素之一。近期,Yavin等[15]比較了PFA 次數(shù)對(duì)于損傷深度的影響,同一部位消融4次造成的損傷(寬度,深度和容積)顯著大于1次消融的損傷。

PFA 的目的是造成目標(biāo)組織細(xì)胞IRE,但同時(shí)還應(yīng)注意,造成IRE的參數(shù)區(qū)間與RE和熱效應(yīng)區(qū)間并沒(méi)有非常清晰的界限,因此,脈沖參數(shù)設(shè)置要兼顧有效性(減少RE)、安全性(減少熱效應(yīng))和減少不良反應(yīng)(骨骼肌收縮)[14]。

4.2 電極導(dǎo)管的設(shè)計(jì)與脈沖消融 導(dǎo)管的形狀和電極的排列對(duì)達(dá)到的損傷深度、達(dá)到該深度所需的電壓,以及由此產(chǎn)生的組織上的熱負(fù)荷分布有較大的影響[16]。在一定范圍內(nèi)增加電極間距和增大消融電極直徑,可以實(shí)現(xiàn)增大損傷范圍的效果。當(dāng)電極間距超出了有效場(chǎng)強(qiáng)的范圍,在兩個(gè)電極之間區(qū)域會(huì)因?yàn)閳?chǎng)強(qiáng)不足出現(xiàn)消融的漏點(diǎn),臨床上通常的解決方案是在原消融平面適當(dāng)旋轉(zhuǎn)一下導(dǎo)管,再進(jìn)行數(shù)次消融,以期望覆蓋電極間的潛在漏點(diǎn)。

消融導(dǎo)管與組織的貼靠對(duì)于PFA 同樣是非常重要的,尤其是要形成透壁損傷時(shí)。組織中的脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度隨著距離的平方下降,最靠近活性電極的組織接受到最強(qiáng)的治療[17]。對(duì)于PFA 來(lái)說(shuō),雖然在零貼靠的情況下仍可以對(duì)附近組織造成一定的損傷,但隨著貼靠力的增加,損傷的深度也會(huì)增加[14,18]。

4.3 細(xì)胞軸向與電場(chǎng)的軸向 不同形狀的細(xì)胞以不同的軸向暴露于脈沖電場(chǎng)環(huán)境中,細(xì)胞膜的穿孔率是不同的[1,12]。心肌細(xì)胞在某些解剖部位,如肺靜脈與左心耳交界的嵴部,具有復(fù)雜的各向異性組織纖維走向[19]。在PFA 過(guò)程中,不同軸向的心肌細(xì)胞穿孔的區(qū)域和數(shù)量也是不均勻的。

4.4 細(xì)胞膜屬性與膜穿孔 不同類型細(xì)胞在脈沖電場(chǎng)下形成IRE 的最小場(chǎng)強(qiáng)差異較大,心肌細(xì)胞形成IRE 的場(chǎng)強(qiáng)閾值是400 V/cm,紅細(xì)胞為1 600 V/cm,血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞為1 750 V/cm,神經(jīng)細(xì)胞為3 800 V/cm[20]。心肌細(xì)胞IRE的閾值低可能跟其細(xì)胞表面有大量電壓門(mén)控的離子通道蛋白表達(dá)有關(guān),同時(shí),也提示只要控制好場(chǎng)強(qiáng)的范圍,就能實(shí)現(xiàn)只對(duì)心肌細(xì)胞的選擇性消融而不損傷周圍組織(如血管,神經(jīng),食管等)的治療目的。此特性對(duì)于除了肺靜脈電隔離消融外還需采用左心房廣泛消融術(shù)式的房顫患者可能有一定獲益,PFA 除了消融心房肌組織外,可保留心房結(jié)構(gòu)的完整性,包括膠原纖維、血管和神經(jīng)組織,從而較大程度保留心房結(jié)構(gòu)和功能[21]。

5 PFA的潛在風(fēng)險(xiǎn)和不良反應(yīng)

脈沖電場(chǎng)作為新的消融能量在心律失常領(lǐng)域展現(xiàn)了安全和高效的優(yōu)勢(shì),但同時(shí)還需要了解和關(guān)注這項(xiàng)技術(shù)目前存在的一些問(wèn)題,包括高電壓的風(fēng)險(xiǎn)、骨骼肌收縮、微泡現(xiàn)象等。

5.1 高輸出電壓的影響 更高的輸出電壓意味著更高的場(chǎng)強(qiáng)和可能更大的損傷范圍。但是,過(guò)大的輸出電壓也會(huì)帶來(lái)安全性的風(fēng)險(xiǎn)[22]:包括出現(xiàn)熱效應(yīng)、增加骨骼肌的收縮、增加微泡的形成,甚至出現(xiàn)電弧。電弧的出現(xiàn)可以造成局部組織的氣壓傷,電弧還會(huì)造成血液在電極表面的結(jié)痂和凝結(jié),影響隨后的消融效果。因此,脈沖消融儀在參數(shù)設(shè)置上要有安全上限值,手術(shù)中對(duì)輸出電壓的調(diào)整不能超過(guò)安全上限,另外,脈沖消融儀還需要能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控是否發(fā)生了電弧,如果發(fā)生,需要能夠自動(dòng)切斷后續(xù)脈沖波的輸出。

5.2 骨骼肌收縮 骨骼肌收縮是PFA 過(guò)程中常出現(xiàn)的伴隨癥狀,尤其是長(zhǎng)時(shí)程的單相脈沖波消融時(shí)。增加脈沖波的頻率,可以顯著減少骨骼肌的收縮和扭矩[23]。目前市場(chǎng)上用于房顫PFA 的主流脈沖消融儀多采用高頻雙相脈沖波,采用較短時(shí)程的消融。

5.3 微泡現(xiàn)象 脈沖波發(fā)放時(shí)可以通過(guò)超聲監(jiān)測(cè)到微泡的發(fā)生。術(shù)中微泡的形成機(jī)制目前還不是非常明確,可能的機(jī)制是血液中氮?dú)獾乃饣蛑脫Q。多個(gè)脈沖參數(shù)(電壓、脈寬等)的改變可以影響微泡的形成。直徑＜38μm 的氣泡被認(rèn)為會(huì)迅速溶解(6～10 s),不太可能導(dǎo)致腦血流受損[19]。目前對(duì)于PFA 過(guò)程中微泡的影響,還缺乏大樣本和長(zhǎng)期的隨訪數(shù)據(jù),值得進(jìn)一步探索。

6 結(jié)語(yǔ)

PFA 的本質(zhì)是細(xì)胞膜的電穿孔,尤其是IRE 的形成。了解膜穿孔的形成機(jī)制以及修復(fù)機(jī)制,有助于更好的設(shè)置脈沖參數(shù),優(yōu)化臨床實(shí)踐。PFA 的結(jié)果是綜合各種因素共同作用的結(jié)果,其中脈沖電場(chǎng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間是決定消融損傷最重要的兩個(gè)因素。通過(guò)不同參數(shù)的有效組合和最終達(dá)到較理想的治療效果。市場(chǎng)上已有的PFA 產(chǎn)品近十余款,每個(gè)公司的消融參數(shù)都不相同,彼此之間很難對(duì)比孰優(yōu)孰劣,對(duì)其有效性的評(píng)估還要結(jié)合更大樣本的臨床數(shù)據(jù)和長(zhǎng)期的隨訪結(jié)果。同時(shí),在探索和臨床應(yīng)用過(guò)程中,還需要逐漸優(yōu)化參數(shù)設(shè)置,減少PFA 相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生強(qiáng)度。