大鼠肝臟組織不可逆電穿孔消融能量效應(yīng)和熱效應(yīng)研究

朱金俊， 黃偉偉， 包家立， 胡亞楠

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要儀器

清潔級Sprague-Dawley大鼠（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供），平均體質(zhì)量200 g。所有實驗過程均符合我國《實驗動物管理條例》有關(guān)條規(guī)。

實驗儀器主要有電脈沖系統(tǒng)OX4-5型電穿孔儀（杭州場皿科技公司），脈沖電場發(fā)生的簡要示意電路如圖1所示，由電源、電容器組、開關(guān)和脈沖控制器、并行電阻及負載組成；YP5008G型多路溫度記錄儀（深圳永鵬儀器公司）。

圖1 脈沖發(fā)生電路

1.2 IRE消融

電脈沖處理前以1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，將脈沖發(fā)生器、電極針進行連接，用鐵架臺固定電極針，針間距為5 mm；大鼠以躺姿固定于手術(shù)臺，手術(shù)區(qū)域消毒并暴露肝臟；將電極垂直插入大鼠肝中，施加電脈沖。實驗分為11組，脈沖個數(shù)分別為10、20、30、40、50、60、70、80、100、120、140個，每組總能量分別為5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70 J。脈沖釋放結(jié)束后將臟器回納腹腔，常規(guī)閉腹并消毒。

1.3 實時溫度測量

通過熱電偶測溫儀分別測量肝臟組織在電脈沖暴露時的實時溫度。熱電偶放置的測量點如圖2所示。共設(shè)置15個測量點，測量點1～5放置于電極針中上側(cè)，間距為2.5 mm；測量點6～10放置于電極針右側(cè)，間距為2.5 mm；測量點11～15放置于電極針的右下側(cè)，間距為2.5 mm。

圖2 熱電偶儀測量點示意圖

1.4 病理檢查

飼養(yǎng)3 d后，對大鼠行安樂死。將肝組織置于4%甲醛溶液中浸泡48 h，石蠟包埋，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，制成組織切片并行蘇木精-伊紅（HE）染色，通過Olympus VS200數(shù)字切片掃描儀進行掃描，獲得病理學(xué)彩色掃描圖。通過ImageJ軟件進行消融面積計算。

1.5 溫度仿真

表1 仿真參數(shù)

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件分析結(jié)果，以均值±標準誤表示，n=3，取平均值進行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用GraphPad Prism 8軟件繪制圖表。

2 結(jié)果

2.1 IRE引起肝臟消融的病理組織學(xué)觀察

組織消融情況如圖3所示，消融區(qū)域邊界清晰。消融1區(qū)域是插入深度約為2 mm、直徑為0.35 mm的電極針所在區(qū)域；2區(qū)域是靠近電極的組織被熱損傷區(qū)域，肝組織結(jié)構(gòu)消失，呈現(xiàn)均勻的紅色染色固化狀態(tài)，中心電極溫度達到組織熱固定閾值（圖3②）；3區(qū)域肝組織結(jié)構(gòu)保留，但肝核消失，肝竇擴張，顯示有Kupffer細胞殘留（圖3②④）；4區(qū)域是修復(fù)與再生結(jié)合區(qū)，大量肉芽組織形成，5區(qū)域中肝細胞輕度受損，呈細胞水腫狀態(tài)（圖3③）。電場暴露引起的消融部位鄰近血管和膽管仍保留完整（圖3⑤）。

圖3 肝臟消融3 d后組織學(xué)所見

2.2 IRE能量效應(yīng)

實驗發(fā)現(xiàn)，電脈沖能量＜20 J時肝臟組織消融面積隨能量逐步增加，最大消融面積約為30 mm2；電脈沖能量＞20 J后，肝臟組織消融面積不再繼續(xù)增大（圖4）。不同能量的組織HE染色切片代表圖如圖5所示。

圖4 能量與肝臟組織消融面積關(guān)系

圖5 不同能量組織HE染色切片代表圖（10×）

2.3 IRE熱效應(yīng)

大鼠肝臟溫度15個測量點（圖2）實時數(shù)據(jù)如圖6所示，實驗發(fā)現(xiàn)在能量為0.5 J、釋放頻率為1 Hz電脈沖下，肝臟溫度在50 s內(nèi)快速上升，在50～150 s進入緩慢上升，在150～200 s溫度趨于穩(wěn)定（圖6①）；在能量為0.25 J、頻率為1 Hz和0.5 J，頻率為0.5 Hz電脈沖作用下，肝臟溫度在100 s內(nèi)上升，在100～200 s溫度趨于穩(wěn)定（圖6②③）。用Sim4Life軟件根據(jù)具體電脈沖參數(shù)對大鼠肝臟溫度分布進行仿真（圖7），可見距離電極越近的區(qū)域，溫度越高；電極針附近等溫線接近圓形，隨著距離增加逐漸變成葫蘆狀，最終呈橢圓形分布；越靠近電極，溫度變化率越大。將15個測量點仿真溫度和實驗測量最終溫度進行對比，數(shù)值高度吻合（圖8）。

圖6 不同參數(shù)脈沖暴露下肝臟溫度實時變化曲線

圖7 不同參數(shù)脈沖暴露下肝臟仿真溫度分布圖

圖8 電脈沖作用下測量最終溫度和仿真溫度對比

3 討論

IRE消融技術(shù)是除了射頻消融［15-16］、微波消融［17-18］、光熱 消融［19］、激光消 融［20］、冷 凍消融［21-22］之外另一種良惡性腫瘤消融方法，具有可應(yīng)用于血管、膽管、胰管和神經(jīng)等重要組織結(jié)構(gòu)附近良惡性腫瘤消融的優(yōu)勢［23］，也可使肝血管肝門得以保留［24］。IRE已成為肝門等重要結(jié)構(gòu)附近良惡性腫瘤安全消融治療的手段之一。然而，IRE在組織消融中的能量效應(yīng)和熱效應(yīng)仍有待進一步研究。本研究通過觀察IRE處理后肝臟組織病理學(xué)切片發(fā)現(xiàn)，肝臟消融區(qū)域與周圍組織有明顯分界，且區(qū)域內(nèi)細胞發(fā)生凝固性壞死，這說明IRE能引起肝組織消融并限定在一定范圍，提示IRE應(yīng)用于肝臟組織消融的有效性；同時發(fā)現(xiàn)IRE在組織消融過程中可避開鄰近血管和膽管，具有保護敏感部位優(yōu)勢（圖3⑤），這提示只要給予的能量合適，IRE對于重要結(jié)構(gòu)周圍良惡性腫瘤的消融具有安全性。

目標組織溫度高于45～50℃這一“致死溫度范圍”20 s后組織就會被高溫破壞［13］。本實驗中采用0.5 J單脈沖能量，以0.5 Hz頻率進行釋放，實時測量目標組織溫度變化，最高溫度位于5號測量點處，約為40℃，比實驗前提高約10℃（圖6③）。通過測量不同電參數(shù)IRE處理時肝臟組織溫度實時變化，均發(fā)現(xiàn)溫度逐漸上升，并最終趨于穩(wěn)定；在相同脈沖頻率下，當能量增加時，組織溫度也會相應(yīng)增加（圖6①②），同時在相同能量條件下，當脈沖頻率增加時，組織溫度也會相應(yīng)增加（圖6①③）。根據(jù)電脈沖具體參數(shù)進行溫度分布仿真模擬發(fā)現(xiàn)，其與實驗得出的最終溫度高度吻合（圖8）。實驗和仿真結(jié)果共同表明，IRE治療過程中熱效應(yīng)是存在的，所以需要在手術(shù)前根據(jù)電脈沖體參數(shù)充分預(yù)測IRE暴露后組織熱量分布。

本研究旨在探索IRE在大鼠肝臟組織消融中的能量效應(yīng)和熱效應(yīng)，結(jié)果顯示消融部位肝臟組織發(fā)生凝固性壞死，消融區(qū)域與周邊組織存在明顯分界，血管膽管未見明顯損傷。IRE在肝臟消融中存在能量效應(yīng)，并可得出對應(yīng)的能量效應(yīng)經(jīng)驗公式，同時IRE也會引起組織熱效應(yīng)。因此，應(yīng)在術(shù)前優(yōu)化電參數(shù)，確定IRE最優(yōu)能量，并避免產(chǎn)生熱損傷。