基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黨參、海藻“藥對”治療肝癌的作用機(jī)制及關(guān)鍵的靶點通路預(yù)測

劉婷婷，李新，楊冰，田成旺，徐旭，李國霞

（1.天津醫(yī)科大學(xué)國際醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合教研室，天津 300070；2.天津藥物研究院，天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點實驗室，天津 300301）

肝癌是全球第6 大最常見惡性腫瘤，我國是肝癌高發(fā)國家，每年全球肝癌新增病例約半數(shù)在中國。由于早期不易發(fā)現(xiàn)、不典型；晚期高轉(zhuǎn)移、高復(fù)發(fā)的特點，導(dǎo)致肝癌死亡率極高，肝癌死亡率從2018 年的第3 位上升到2020 年的第2 位，僅次于肺癌[1-2]。盡管傳統(tǒng)的肝臟切除術(shù)、肝臟移植術(shù)、靶向治療、放射介入和局部消融等新興治療手段的出現(xiàn)，使得肝癌的治療效果不斷提高，但肝癌發(fā)展迅速使得預(yù)后并不理想，因此尋找靶向清晰、高效低毒的新型抗肝癌藥物是今后肝癌研究的重要任務(wù)。

《諸病源候論》積聚病諸候篇中“諸臟受邪，初未能成積聚，留滯不去，乃成積聚?！闭J(rèn)為肝癌的發(fā)生是外感六淫邪氣，內(nèi)在機(jī)體虛損、情志內(nèi)傷以及飲食不節(jié)等因素引起肝脾功能失調(diào)，寒積、痰濁、氣滯、血瘀、濕邪熱毒等實邪長期積聚形成[3]。同時，正邪交爭是癌癥發(fā)生的關(guān)鍵，人體正氣充足時能抵抗邪氣的入侵，不會發(fā)生癌癥，相反則會發(fā)生癌變。中醫(yī)治療原發(fā)性肝癌最常用的治法是“益氣軟堅”：“益氣”即增強(qiáng)自身免疫以抵御外邪，“軟堅”即軟堅散結(jié)消炎，目的是從根本上扶助正氣的同時祛除毒邪、消散腫瘤，改善機(jī)體邪盛正衰的狀態(tài)[4]。本次網(wǎng)絡(luò)藥理實驗依據(jù)中醫(yī)治療肝癌法則之“益氣軟堅”，選用黨參作為“益氣”之用，海藻發(fā)揮“軟堅”之功，探討該“藥對”治療肝癌化學(xué)成分及其作用機(jī)制。

《本草從新》首載“黨參”，屬于上等之佳品，味甘、性平，歸脾、肺二經(jīng)，有補(bǔ)中益氣、健脾益肺、養(yǎng)血生津之效?，F(xiàn)代藥理研究證實黨參多糖可以抗腫瘤、提高免疫和抗疲勞等[5-6]。海藻始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦、咸，性寒，歸肝、胃、腎經(jīng)，有軟堅、化痰、利水、消腫的功效[7]。近年來，海藻在治療各種腫瘤中顯示出獨特的優(yōu)勢，未來具有不錯的發(fā)展前景[8]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 對照品巖藻甾醇（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號99718），粉末4℃避光保存，購自美國MCE 公司。

1.1.2 細(xì)胞株 人HepG2 肝癌細(xì)胞，購自武漢普諾賽生物科技有限公司。

1.1.3 試劑 DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（批號8121330）、胎牛血清（批號2279804CP）、0.25%胰蛋白酶（批號2186962）購自美國Gibco 公司；100×青霉素-鏈霉素溶液（批號C0222）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO，批號D8371）購自索萊寶公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）粉劑（批號MKCL9866）購自美國Sigma 公司。

1.1.4 儀器 Multiskan Go 全自動酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）；TDL80-2B 型臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；CKX-41 型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；SeriesⅡ型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；Revco PLUS 型-80℃冰箱（美國Thermo 公司）；超微量移液器（美國Thermo 公司）；超凈工作臺（上海Heal Force 公司）；細(xì)胞計數(shù)板（上海市求精生化試劑儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 獲取黨參、海藻化學(xué)成分 本研究從中藥系統(tǒng)藥理分析數(shù)據(jù)庫（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database，TCMSP）以及“中國知網(wǎng)”中獲取黨參、海藻化學(xué)成分。篩選條件是根據(jù)TCMSP 數(shù)據(jù)庫中藥物動力學(xué)（absorption and distribution andmetabolismand excretion，ADME）參數(shù)而定，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性指數(shù)（DL）≥0.18 為條件，篩選符合的化學(xué)成分。由于TCMSP 中收錄的化學(xué)成分有局限性，另外采用文獻(xiàn)挖掘的方法從“中國知網(wǎng)”中補(bǔ)充收集黨參、海藻“藥對”的化學(xué)成分。

1.2.2 獲得黨參、海藻化學(xué)成分的潛在作用靶點（1）從TCMSP 數(shù)據(jù)庫得到活性成分的部分靶點。（2）從PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到活性成分的Canonical SMILES，將其輸入SEA數(shù)據(jù)庫（http://sea.bkslab.org/）獲得活性成分的部分靶點。（3）從《中藥活性成分分析手冊》中查到黨參、海藻化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）獲得部分靶點。去掉重復(fù)靶點，得到最終靶點。

1.2.3 檢索肝癌的作用靶點 從TTD（http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）或OMIM數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org/）中搜集與肝癌相關(guān)的靶點，輸入“Liver cancer”、“Human hepatocellular carcinoma”等關(guān)鍵詞匯進(jìn)行搜索，取得分≥0.4 的靶點。將挖掘得到的肝癌相關(guān)基因與黨參、海藻“藥對”靶點基因互相映射，獲得黨參、海藻“藥對”治療肝癌的作用靶點。

1.2.4 構(gòu)建黨參、海藻-化合物-靶點-肝癌網(wǎng)絡(luò) 使用Cytoscape3.8.2 軟件來構(gòu)建黨參、海藻-化合物-靶點-肝癌的可視化網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測化合物和靶點之間的關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點（node）表示黨參、海藻、肝癌、化合物以及靶點，以邊（edge）表示藥物化合物與靶點之間的聯(lián)系，靶點是肝癌與活性成分共有的靶點。

1.2.5 黨參、海藻“藥對”與肝癌作用靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將關(guān)鍵靶點在STRING 在線分析平臺（https://string-db.org/）構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，最低相互作用評分設(shè)為“medium confidence”（＞0.4），選擇隱藏游離節(jié)點，其他保持默認(rèn)值，限定研究物種為“Homo sapiens”，最后Cytoscape3.8.2 軟件以度值為標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6 GO 生物功能、KEGG 通路富集分析 運用OmicsBean 數(shù)據(jù)庫（http://www.omicsbean.cn/）獲得32 個靶點蛋白的基因本體（GO）功能及基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，GO 富集分析的結(jié)果有3 大類，分別為“藍(lán)色”生物過程（BP）、“紅色”細(xì)胞化合物（CC）和“黃色”分子功能（MF）。以P＜0.05 為限定條件，從基因生物功能與信號通路角度進(jìn)一步明確黨參、海藻”藥對”對治療肝癌的作用機(jī)制。

1.2.7 細(xì)胞培養(yǎng) 人HepG2 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 完全培養(yǎng)基，5%CO2、飽和濕度的37℃恒溫培養(yǎng)箱中生長。生長至對數(shù)生長期且狀態(tài)良好時，用胰蛋白酶消化傳代，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.8 MTT 法檢測巖藻甾醇對人HepG2 肝癌細(xì)胞增殖的影響 96 孔板中每孔接種100 μL HepG2細(xì)胞懸液，繼續(xù)生長至約40%時加入不同濃度的巖藻甾醇溶液（0、0.06、0.12、0.24 mmol/L），每組設(shè)6 個復(fù)孔，處理24 h，每孔加5 mg/mL MTT 溶液20 μL，孵育4 h，DMSO 振蕩搖勻10 min，測490 nm 處的吸光度（A490 值），重復(fù)3 次。計算各組巖藻甾醇溶液對HepG2 細(xì)胞的抑制率：（1-A給藥組/A空白對照組）×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0 軟件實現(xiàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，計量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 獲取黨參、海藻化學(xué)成分 從TCMSP、中國知網(wǎng)中獲得黨參、海藻化合物成分29 種，剔除3 個未查詢到靶點的化合物，剩余26 種活性化合物，其中黨參20 種、海藻6 種，未有重復(fù)成分，化合物信息見表1。

表1 黨參20 種、海藻6 種化學(xué)成分基本信息Tab 1 Basic information of chemical constituents of 20 species of Codonopsispilosula and 6 species of Sargassum

2.2 獲得黨參、海藻化學(xué)成分的潛在作用靶點 通過TCMSP、SEA、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫檢索29 種活性化合物潛在的相關(guān)靶點，收集到靶點黨參有978 個，海藻有839 個，去除重復(fù)后得到靶點964 個。

2.3 檢索肝癌的作用靶點 通過TTD、OMIM 數(shù)據(jù)庫，共獲得與肝癌相關(guān)的486 個靶點。黨參、海藻“藥對”治療肝癌的共同潛在作用靶點有32 個，見表2。

表2 黨參、海藻“藥對”治療肝癌的32 個共同潛在作用靶點Tab 2 32 common potential targets of "drug pair" of Codonopsispilosula and Sargassum in the treatment of liver cancer

2.4 構(gòu)建黨參、海藻-化合物-靶點-肝癌網(wǎng)絡(luò) 對黨參、海藻“藥對”含有的化合物、化合物靶點以及肝癌靶點、肝癌進(jìn)行關(guān)聯(lián)，利用軟件Cytoscape3.8.2 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，圖1 為得到的網(wǎng)絡(luò)圖（紅色為共同靶點，藍(lán)色為化合物，綠色為海藻，黃色為黨參，紫色為疾病肝癌）。圖中有26 種化合物節(jié)點，32 個靶點節(jié)點，2 個藥物節(jié)點，1 個疾病節(jié)點。在網(wǎng)絡(luò)圖中一個節(jié)點連接線的數(shù)目稱為度，度的高低代表節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度。

圖1 黨參、海藻-化合物-靶點-肝癌網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Codonopsispilosula，Sargassum -compound-target-liver cancer network map

2.5 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)、關(guān)鍵基因分析 將32 個黨參、海藻“藥對”與肝癌共同靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)，隱藏3 個游離節(jié)點之后PPI 網(wǎng)絡(luò)包含29個靶基因節(jié)點，共有199 條相互作用連線（圖2）。之后導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 軟件，獲得各個蛋白的度值大小，PPI 網(wǎng)絡(luò)代表各個蛋白與其他蛋白相互作用，度值越大表示該蛋白在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用越大，先根據(jù)度值篩選出前10 位，見表3。其中細(xì)胞表皮生長因子受體（EGFR）、蛋白激酶B（AKT1）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）與TP53 是表3 中度值最大的前4 位，預(yù)測可靠性更高、結(jié)構(gòu)更精準(zhǔn)，因此選擇前4位靶點作為本次網(wǎng)絡(luò)藥理篩選出的關(guān)鍵靶點。

表3 蛋白度值表（按由大到小篩選出前10 位）Tab 3 Proteinvaluetable（thetop10arescreenedfromlargetosmall）

圖2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Protein interaction network diagram

2.6 GO 集分析和KEGG 分析黨參、海藻“藥對”的32 個共同潛在靶點在信號通路中的作用 篩選BP、CC 和MF 的前10 個富集條件作圖，其中BP（生物學(xué)過程）涉及細(xì)胞增殖、程序性死亡調(diào)節(jié)、凋亡過程負(fù)調(diào)控和催化調(diào)節(jié)等多個生物過程，基因占比均＞50%；CC（細(xì)胞化合物）涉及胞質(zhì)、細(xì)胞器以及細(xì)胞核等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)占比最高，除膜筏、核染色區(qū)占比較低之外，其他基因占比均在40%以上；MF（分子功能）涉及最關(guān)鍵的是蛋白質(zhì)二聚活性，基因占比約90%左右（圖3、表4）。此外黨參、海藻“藥對”治療肝癌的KEGG 分析，根據(jù)P 值和分?jǐn)?shù)篩選出前10 條KEGG 通路（P＜0.05），其中信號通路包括癌癥通路、MAPK 信號通路、PI3K-AKT 信號通路和Ras信號通路等，疾病通路有乙型肝炎、丙型肝炎、肝癌、結(jié)直腸癌等，其中MAPK 和PI3K-AKT 是最關(guān)鍵的兩條通路（表5、圖4），圖4 中P 值越小，圓圈越大，關(guān)聯(lián)度越大，顏色越深。

圖4 黨參、海藻“藥對”治療肝癌KEGG 通路富集分析氣泡圖Fig 4 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis of Codonopsispilosula and Sargassum"drug pair"in the treatment of hepatocellular carcinoma

表4 黨參、海藻“藥對”治療肝癌潛在靶點GO 富集結(jié)果(各前10 條)Tab 4 GO enrichment results of potential targets of Codonopsispilosula and Sargassum"drug pairs"in the treatment of liver cancer(top 10 each)

表5 黨參、海藻“藥對”治療肝癌潛在靶點KEGG 富集分析（前10 條）Tab 5 KEGG enrichment analysis of potential targets of Codonopsispilosula and Sargassum "drug pair" in the treatment of hepatocellular carcinoma（Top 10）

圖3 黨參、海藻“藥對”治療肝癌的潛在靶點GO 富集分析柱狀圖Fig 3 Histogram of GO enrichment analysis of potential targets of"drug pair"of Codonopsispilosula and Sargassum in the treatment of liver cancer

2.7 巖藻甾醇對人HepG2 肝癌細(xì)胞增殖的影響如表6 所示，與空白對照組（0 mmol/L）相比，巖藻甾醇各劑量組細(xì)胞存活率明顯降低，差異均有顯著性（均P＜0.05）。

表6 巖藻甾醇對人HepG2 肝癌細(xì)胞增殖抑制率的影響（±s，n=6）Tab 6 Effect of fucosterol on proliferation inhibition rate of human HepG2 hepatoma cells（±s，n=6）

表6 巖藻甾醇對人HepG2 肝癌細(xì)胞增殖抑制率的影響（±s，n=6）Tab 6 Effect of fucosterol on proliferation inhibition rate of human HepG2 hepatoma cells（±s，n=6）

注：與空白對照組相比，*P<0.05

組別 細(xì)胞增殖抑制率（%）空白對照組 0 15.10±3.10*巖藻甾醇組 26.46±2.45*31.22±1.67*濃度（mmol/L）0 0.06 0.12 0.24 OD 值(A490 nm)0.368±0.009 0.312±0.011 0.270±0.011 0.253±0.018

3 討論

黨參、海藻“藥對”抗肝癌網(wǎng)絡(luò)藥理實驗獲得4 種有后續(xù)研究意義的化合物，依次為木犀草素、黨參炔苷、槲皮素、巖藻甾醇。木犀草素與槲皮素是大多數(shù)中藥普遍含有的活性化學(xué)物質(zhì)，目前已有許多文獻(xiàn)報道其有抗腫瘤作用，對于肝癌也有不錯的治療效果。黨參炔苷是黨參的主要代表成分，海藻多糖由于種類繁多且結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，TCMSP 數(shù)據(jù)庫并未收入，因此巖藻甾醇作為海藻主要代表成分，目前還未有文獻(xiàn)報道顯示黨參炔苷與巖藻甾醇可以抗肝癌，本次網(wǎng)絡(luò)藥理預(yù)測結(jié)果顯示黨參炔苷與巖藻甾醇對于肝癌的治療有一定的作用；EGFR、AKT1、VEGFA與TP53 等為主要作用靶點；MAPK 和PI3K-AKT等為最主要的信號通路。

木犀草素（Luteolin）是一種天然黃酮類化合物，主要存在于十字花科、天南星科、傘形科等藥物和蔬菜中，有抗肝癌作用[9]。槲皮素（Quercetin）廣泛存在于各種食品中，功效有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤等[10]，據(jù)報道顯示槲皮素可以抑制人肝癌HepG2 細(xì)胞增殖和遷移[11]。巖藻甾醇（Fucosterol）是從褐藻中提取的一種成分，研究表明巖藻甾醇可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞增殖[12]，目前尚未有抗肝癌的報道。黨參炔苷（Lobetyolin）是一種聚乙炔糖苷，在黨參屬植物中含量較高，實驗證明黨參炔苷呈劑量依賴性（10～40 μmol/L）抑制體外培養(yǎng)的HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)caspase 依賴性的凋亡[13]，目前黨參炔苷尚未有抗肝癌的報道。

EGFR 是一種酪氨酸激酶，其過表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作用于下游相關(guān)信號通路來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[14]。AKT1 是PI3K/AKT 信號通路重要的下游靶標(biāo)[15]。AKT1 可通過抑制細(xì)胞凋亡而促使細(xì)胞存活，AKT1 被磷酸化激活預(yù)示著肝癌細(xì)胞有侵襲性[16]。VEGFR 參與血管相關(guān)細(xì)胞的分裂、增殖和遷移，腫瘤血管的形成是誘發(fā)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的必要步驟[17]。TP53 是一種抑癌基因，若該基因發(fā)生突變將會促進(jìn)腫瘤發(fā)展，同時細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、血管生成和抑制轉(zhuǎn)移等也會隨之相應(yīng)改變[18]。目前槲皮素、木犀草素均被發(fā)現(xiàn)可抑制人肝癌細(xì)胞中AKT1 蛋白的磷酸化激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19-20]。研究顯示[21-22]，槲皮素、木犀草素可激活P53 信號通路中TP53 抑癌基因，造成胰腺癌、肝癌和結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞凋亡。巖藻甾醇與黨參炔苷未有相關(guān)研究證實是通過以上分子發(fā)揮作用，今后還需不斷探索。

MAPK 信號通路包括ERKs、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK 介導(dǎo)通路[23]。研究證明ERKs、JNK 和p38MAPK 信號通路都能引起HepG2 細(xì)胞G2/M 周期阻滯，從而起到抗肝癌細(xì)胞增殖的效果[24]。PI3K/AKT 信號通路對細(xì)胞凋亡發(fā)揮著重要調(diào)控作用[25]。諸多研究將PI3K/AKT 信號通路作為治療慢性肝病的重要靶標(biāo)[26]。孫佳等[27]證明槲皮素能下調(diào)肝癌細(xì)胞PI3K/AKT 通路，增強(qiáng)凋亡因子、降低抗凋亡蛋白的活性，從而促使肝癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗肝癌的作用。

綜上所述，黨參、海藻治療肝癌是多成分、多靶點、多生物過程而實現(xiàn)的，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治病的整體理念，為后續(xù)相關(guān)研究提供實驗依據(jù)。本實驗通過MTT 法初步驗證巖藻甾醇可以抑制HepG2 肝癌細(xì)胞增殖，且與濃度呈正相關(guān)。后期將以上述實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，繼續(xù)通過細(xì)胞和動物實驗深入研究，為黨參、海藻藥對抗肝癌提供扎實有力的實驗依據(jù)。