高脂飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制研究

李 春，梅 聰，周 瓊，朱麗芹，王毅鵬，翁曉春，周松蘭，唐 哲

（昆明市延安醫(yī)院內(nèi)分泌科，云南 昆明 650051）

隨著人們生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）對(duì)人類健康的危害也越來(lái)越大[1，2]。NAFLD 包括單純性脂肪肝（nonalcoholicsimple fatty liver，NAFL）、脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纖維化、肝硬化，甚至進(jìn)展為肝細(xì)胞癌等一系列相互聯(lián)系的病理改變[3]。與單純NAFLD 患者相比，NASH 的存在增加了肝臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)，也可能增加心血管疾病和惡性腫瘤等非肝臟相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4-6]。NAFLD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，“二次打擊”理論（Two hit theory）其中之一，第一次打擊誘發(fā)肝臟脂肪變性，第二次打擊來(lái)自氧化應(yīng)激引起炎癥、纖維化、壞死等[7]。Kupffer 細(xì)胞在經(jīng)典激活（M1）和選擇性激活（M2）兩種狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換可能也在NAFLD 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8，9]?；诖?，本研究通過(guò)高脂飲食建立NAFLD 的小鼠模型，動(dòng)態(tài)觀察小鼠肝臟的Kupffer細(xì)胞在疾病的發(fā)展和演變過(guò)程中的變化，分析其在炎癥募集和炎癥持續(xù)機(jī)制中的作用，明確Kupffer 細(xì)胞在M1 和M2 之間的轉(zhuǎn)換與NAFLD 發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 30 只C57BL/6J 小鼠購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，PBS 溶液：將1 包磷酸緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）粉劑（購(gòu)自索萊寶）完全溶解于2000 ml 蒸餾水中，混勻后，調(diào)整pH 值在7.2～7.4 備用。4%多聚甲醛：將40 g 多聚甲醛（購(gòu)自Sigma）完全溶解于加熱的1000 ml 蒸餾水中，恢復(fù)室溫后備用。甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、胰島素和血糖試劑盒購(gòu)自Elabscience。IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS，MCP-1、VEGF 和IL-10 的ELISA 試劑盒購(gòu)自Abcam。

1.2 高脂飲食誘導(dǎo)小鼠NAFLD 模型 30 只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為普通飲食組、4 周高脂飲食組（88%普通飲食+10%豬油+2%膽固醇）和8 周高脂飲食組，每組10 只。所有食物均經(jīng)高溫消毒滅菌后使用。飼養(yǎng)環(huán)境條件：溫度20 ℃～22 ℃，濕度50%～55%，明暗各12 h。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 小鼠狀態(tài)監(jiān)測(cè) 每周稱重1 次小鼠體重，觀察其食欲行為、精神狀態(tài)和毛發(fā)情況等。

1.3.2 標(biāo)本采集 小鼠處死前隔夜禁食，使用異氟烷吸入麻醉。切開腹腔后從下腔靜脈取血，采集的血液標(biāo)本在4 ℃下1000xg 離心10 min 后，取上層血清，保存在-80 ℃冰箱用于后續(xù)檢測(cè)。切開右心房，以22G 導(dǎo)管行門靜脈插管，用PBS 以10 ml/min 灌注肝臟5 min 后摘取肝臟。切取2 cm×2 cm 大小肝臟組織，使用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切成5 μm 組織切片用于HE 染色。肝組織切片經(jīng)HE染色后，光鏡下評(píng)估肝脂肪變性和炎癥活動(dòng)情況，HE 切片用OLYMPUS 攝像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和攝片。剩余的肝臟組織剪碎，用于Kupffer 細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)，加入30 ml 濃度為1 mg/ml 的Ⅳ型膠原酶液37 ℃水浴消化30 min，用100 μm 濾網(wǎng)過(guò)濾消化液，留取濾液，4 ℃下300xg 離心5 min，2 次，棄上清，以PBS 重懸沉淀，4 ℃下50xg 離心3 min，上層懸液再以300xg 離心5 min，棄上清，沉淀用高糖DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 U/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素）重懸，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)2 h，棄去培養(yǎng)液，以PBS 洗滌1 次，再加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè) 參考說(shuō)明書使用TG、TC、ALT、AST、胰島素（I）、血糖（G）試劑盒分別檢測(cè)不同飲食組小鼠血清中各指標(biāo)的含量。

1.3.4 細(xì)胞因子檢測(cè) Kupffer 細(xì)胞以PBS 洗滌3次后，用高糖DMEM 培養(yǎng)基（100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素）重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每組3 個(gè)復(fù)孔，于24 h 后收集培養(yǎng)上清，根據(jù)說(shuō)明書應(yīng)用ELISA 試劑盒檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS、MCP-1、VEGF 和IL-10指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有的數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 7.0 處理。連續(xù)型變量以（）表示，分類變量以（%）表示。連續(xù)型變量使用非配對(duì)t檢驗(yàn)，分類變量使用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠狀態(tài)比較 各組小鼠在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)結(jié)束前均無(wú)死亡，習(xí)性、毛發(fā)、活動(dòng)等均無(wú)異常。在高脂飲食初期，各組小鼠進(jìn)食量無(wú)顯著變化，之后4 周高脂飲食組和8 周高脂飲食組的小鼠進(jìn)食量增加。三組實(shí)驗(yàn)前體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；處死時(shí)，高脂飲食組的小鼠體重高于對(duì)照組，且8 周高脂飲食組體重高于4 周高脂飲食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠體重變化情況（，g）

表1 各組小鼠體重變化情況（，g）

2.2 三組血清學(xué)指標(biāo)比較 4 周高脂飲食組和8 周高脂飲食組胰島素、血糖、TG、TC、AST 和ALT 水平均高于普通飲食組，且8 周高脂飲食組高于4 周高脂飲食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖1。

圖1 三組血清學(xué)指標(biāo)比較圖

表2 三組血清學(xué)水平比較（n=10，）

表2 三組血清學(xué)水平比較（n=10，）

2.3 三組組織學(xué)觀察 普通飲食組小鼠肝臟外觀表現(xiàn)尺寸正常，密度正常，有光澤，質(zhì)軟，色澤深紅色，邊緣銳利。肝組織切片HE 染色后可見肝細(xì)胞大小正常，呈竇索狀分布，細(xì)胞內(nèi)未見脂肪浸潤(rùn)，無(wú)小葉和匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)纖維組織形成，見圖2A。4 周高脂飲食組肝臟明顯腫脹增大，色澤土黃，邊緣鈍，標(biāo)本密度降低（漂浮于中性甲醛液面上）。組織切片可見脂滴彌漫浸潤(rùn)肝細(xì)胞中，脂肪變性的肝細(xì)胞極度腫脹呈圓形，體積較正常明顯增加；8 周高脂飲食組的肝臟外觀與4 周高脂飲食組相似，標(biāo)本密度降低更明顯；組織切片可見脂滴彌漫浸潤(rùn)肝細(xì)胞中，脂肪變性的肝細(xì)胞極度腫脹呈圓形，體積較正常明顯增加，胞漿的脂肪空泡較4 周高脂飲食組增多，呈大泡型。

圖2 三組肝臟組織觀察（HE 染色，×40）

2.4 三組細(xì)胞因子水平表征 4 周高脂飲食組和8 周高脂飲食組TNF-α、IL-6、MCP1、IL-1β、iNOS 及VEGF 水平均高于普通飲食組，且8 周高脂飲食組高于4 周高脂飲食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；4 周高脂飲食組和8 周高脂飲食組IL-10 水平低于普通飲食組，且8 周高脂飲食組低于4 周高脂飲食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3、圖3。

圖3 三組促炎和抗炎細(xì)胞因子比較圖

表3 三組炎癥因子水平比較（n=10，）

表3 三組炎癥因子水平比較（n=10，）

3 討論

NAFLD 是最常見的慢性肝病。2 型糖尿病是NAFLD 的重要危險(xiǎn)因素。NAFLD 患者通常表現(xiàn)為胰島素抵抗，并且血糖上升或合并糖尿病的患者的死亡率顯著上升[10]。此外，T2DM 似乎加速了NAFLD肝臟疾病的進(jìn)展，必須優(yōu)先提高對(duì)2 型糖尿病患者非酒精性脂肪肝重要性的認(rèn)識(shí)[11，12]。本研究通過(guò)高脂飲食飼養(yǎng)小鼠建立NAFLD 動(dòng)物模型，結(jié)果顯示4周高脂飲食組和8 周高脂飲食組胰島素、血糖、TG、TC、AST 和ALT 水平均高于普通飲食組，且8 周高脂飲食組高于4 周高脂飲食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。除了TG 和TC 升高外，小鼠胰島素水平和血糖水平也顯著升高，提示NAFLD 合并糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。另外，AST 和ALT 的升高也反應(yīng)當(dāng)前肝臟組織的炎癥損傷狀態(tài)。

除了血液檢測(cè)指標(biāo)之外，肝臟組織切片染色可直接顯示NAFLD 的病理過(guò)程變化，并且在疾病的診斷中發(fā)揮重要作用。既往有學(xué)者報(bào)道了一種基于脂肪變性程度的NAFLD 組織病理學(xué)損害分級(jí)和分期系統(tǒng)[13]。本研究中肝臟組織HE 染色顯示臟明顯腫脹增大，可見脂滴彌漫浸潤(rùn)肝細(xì)胞中，脂肪變性的肝細(xì)胞極度腫脹呈圓形，體積較正常明顯增加。高脂飲食組肝臟組織分離和原代培養(yǎng)的Kupffer 細(xì)胞（肝巨噬細(xì)胞）分泌大量促炎癥細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-6、MCP1、IL-1β、iNOS 和VEGF，此外抗炎細(xì)胞因子IL-10水平分泌顯著降低。表明NAFLD 小鼠模型的血糖和胰島素水平均升高，這與臨床中NAFLD 患者死亡的高危因素包括糖尿病密切相關(guān)[14]。而小鼠肝臟組織切片表現(xiàn)出的肝臟明顯腫脹增大，色澤土黃，邊緣鈍，標(biāo)本密度降低，脂滴彌漫浸潤(rùn)肝細(xì)胞中，脂肪變性的肝細(xì)胞極度腫脹呈圓形，體積較正常明顯增加，這些特征均是NAFLD 的典型病理特征。分析原因?yàn)镵upffer 細(xì)胞能通過(guò)M1 和M2 通路進(jìn)行轉(zhuǎn)換和調(diào)節(jié)。已有研究表明[15-17]，破壞Kupffer 細(xì)胞可以減輕肝臟的組織學(xué)表現(xiàn)，如脂肪變性、炎癥、壞死等。M1/M2 型Kupffer 細(xì)胞比例失調(diào)會(huì)引起NAFLD 向肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)變，其比例顯著降低，提示增加M1 型Kupffer 細(xì)胞的數(shù)量可能是潛在的逆轉(zhuǎn)NAFLD 發(fā)展為肝癌的重要手段[18]。另有研究則顯示脂質(zhì)可誘導(dǎo)Kupffer 細(xì)胞分化，并且不同類型的脂質(zhì)誘導(dǎo)分化的能力不同，本研究同樣使用高脂飲食來(lái)使Kupffer 細(xì)胞釋放更多促炎癥細(xì)胞因子，抑制抗炎細(xì)胞因子釋放，其結(jié)果一致[19]。長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)可恢復(fù)NAFLD 肥胖小鼠Kupffer 細(xì)胞受損的吞噬能力，可能是通過(guò)增加脫氫表雄酮（DHEA）產(chǎn)生，改善肝臟炎癥和纖維化防止NASH 發(fā)生[20]，提示肝臟Kupffer 細(xì)胞功能的異常在NAFLD進(jìn)展中的重要作用。

綜上所述，本研究通過(guò)血液指標(biāo)和組織切片圖像證實(shí)了脂肪肝形成的病理生理學(xué)特征以及炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，Kupffer 細(xì)胞促炎細(xì)胞因子分泌增加而抗炎細(xì)胞因子水平下降使肝臟組織處于高炎癥狀態(tài)，向M1 型巨噬細(xì)胞分化造成組織炎癥損傷是NAFLD 進(jìn)展的關(guān)鍵因素。