miR-622 抑制物對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響研究

沈嚴嚴，文 南，湯 盼

（1.南華大學附屬南華醫(yī)院超聲科，湖南 衡陽 421002；2.南華大學衡陽醫(yī)學院，湖南 衡陽 421000）

乳腺癌（breast cancer）是除東非地區(qū)外，女性患者最常罹患的惡性腫瘤，也是全球11 個地區(qū)中因惡性疾病致死的最常見原因[1]?，F(xiàn)如今乳腺癌的治療方法主要有放療、新輔助化療、手術切除、靶向生物治療等方式，但存在晚期轉移、復發(fā)的風險，以及化療藥物耐藥，給臨床治療帶來了巨大困難[2]。因此，需要深入研究乳腺癌發(fā)病機制，尋找治療乳腺癌的新通路、新靶點。微小RNA（microRNA，miRNA）通過與目標基因mRNA 互補結合負性調控mRNA 的穩(wěn)定性或遏制其翻譯效率從而調控生命活動，是一串內源性單鏈非編碼RNA，其在乳腺癌中的致病作用機制的研究中已成為一大熱點[3]。miR-622 近來被廣泛報道是miRNA 家族中的主要成員，在多項研究中顯示miR-622 可調控癌癥相關通路抑制癌癥發(fā)展，是癌癥的抑制因子[4，5]。研究顯示[4-6]，miR-622 在胃癌、乳腺癌等癌癥中作用異常，而miR-622 在乳腺癌中起致癌還是抑癌作用仍存在爭議。miRNA 在腫瘤中的作用機制通常與多種蛋白有關[7]。Wang X等[8]報道顯示，miR-622 抑制K-Ras 的表達起抑癌作用。而生物信息學研究顯示miR-622 也與EYA1有預測的可能結合位點。miR-622 與EYA1 在癌癥中作用關系的研究尚不清楚，EYA1 是兼具有轉錄活性與磷酸酶活性的轉錄因子，最初在果蠅中被發(fā)現(xiàn)在調控眼睛形態(tài)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。本研究采用qRT-PCR 檢測人乳腺癌細胞株MCF-7 中miR-622 的表達情況，通過miR-622 inhibitor 抑制miR-622 的表達后觀察癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的變化，以及乳腺癌細胞中EYA1 的表達情況，探討miR-622 在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的可能作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人乳腺癌細胞系MCF-7 從南華大學附屬第一醫(yī)院臨床研究所獲??；雙抗、胎牛血清、胰酶、DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；RIPA 細胞裂解液（上海雅吉生物科技有限公司）；Western blot試劑盒、BCA 試劑盒、HE 染色試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；GAPDH 一抗、EYA1 一抗、HRP Goat Anti-Rabbit IgG（美國ABclonal 公司）；CCK-8 試劑盒、ECL 高效化學發(fā)光試劑盒（美國Genview 公司）；PVDF 膜（美國GE 公司）；預染蛋白marker（上海百賽生物科技有限公司）；通用型microRNA 提取試劑盒（北京金百特生物技術有限公司）；miRNA 1st StrandcDNA Synthesis Kit、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；引物（上海生工生物工程股份有限公司）；DEPC 水（上海碧云天生物技術有限公司）；miR-NC、miR-622 inhibitor、Ribofactamine 試劑盒（廣州銳博生物技術有限公司）；Matrigel（美國BD公司Becton，Dickinson and Company）。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染 取對數(shù)生長期乳腺癌MCF-7 細胞接種于6 孔板中，待細胞生長融合度達30%～50%時，根據(jù)制造商提供的說明，使用Ribofactamine 轉染試劑將miR-622 inhibitor、miR-NC 轉染到MCF-7細胞中。設為miR-622 inhibitor 組、miR-NC 組，另設control 組。將細胞放到37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24～36 h 后，利用倒置熒光顯微鏡觀測miR-622 的表達情況，并檢測轉染效率。

1.2.2 RNA 提取與qRT-PCR 檢測 根據(jù)RNA 提取試劑盒說明提取細胞系中總RNA，使用反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄成cDNA。合成特異性miRNA-622 引物和U6 內參引物。使用qRT-PCR 試劑盒進行檢測。反應程序：預變性95 ℃10 s；95 ℃5 s，40×；溶解曲線程序：95 ℃60 s，55 ℃30 s，95 ℃30 s。完成定量后進行相對定量分析（2-△△Ct），得出miRNA-622 相對表達量。所有反應均進行3 次。

1.2.3 細胞增殖 根據(jù)說明用細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測細胞增殖能力。轉染后，收獲穩(wěn)定轉染的MCF-7 細胞，并以每孔5.0×103個細胞的密度接種到96 孔板上，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 和72 h 后，分別用20 μl CCK-8 試劑處理細胞，并在37 ℃條件下孵育2 h。使用多功能酶標儀測量450 nm 處的OD 值。所有實驗重復3 次。

1.2.4 細胞遷移 通過進行傷口愈合試驗來評估細胞遷移能力。轉染48 h 后，將對數(shù)生長期的MCF-7 細胞接種到6 孔板中，調整細胞濃度至2×105個/孔。待細胞生長融合度至80%～90%時，使用無菌的10 μl移液管尖端在每個孔的中心處劃傷。細胞劃傷后用磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffered saline，PBS）洗去脫落的細胞，將剩余的細胞置于37 ℃培養(yǎng)12 h。在0 h 和12 h 分別用顯微鏡拍攝照片。對于每個圖像，劃痕兩側之間的距離使用ImageJ 軟件進行測量。細胞遷移實驗獨立進行3 次。

1.2.5 細胞侵襲 根據(jù)制造商的說明，在Transwell 小室（Becton，Dickinson and Company，USA）中評估MCF-7 細胞侵襲能力。將Matrigel 預先包被在Transwell 上室，然后將轉染48 h 后對數(shù)生長期各組細胞重懸于無血清培養(yǎng)基中，按照1×104細胞/孔的量接種在Matrigel 上。向下室中加入含有20%FBS培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。用棉簽輕輕拭去上室的細胞和多余Matrigel 膠，4%甲醛固定10 min，PBS 清洗3 次后，根據(jù)HE 染色試劑盒染色。PBS 清洗后隨機選取5 個顯微鏡下視野觀察侵襲細胞數(shù)。

1.2.6 EYA1 蛋白檢測 采用Western blot 試劑盒檢測EYA1 蛋白表達水平。收集各組細胞，RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白樣品進10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），轉PVDF 膜。封閉液封閉2 h 后，加入一抗EYA1（1∶5000 稀釋）或GAPDH（1∶5000 稀釋），4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗HRP Goat Anti-Rabbit IgG（1∶5000 稀釋），室溫孵育1 h。用ECL 高效化學發(fā)光試劑盒檢測條帶，采用ImageJ 凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶吸光度，以目的條帶和GAPDH 條帶的比值作為蛋白表達水平。實驗獨立進行3 次。

1.3 統(tǒng)計學分析 利用SPSS 21.0 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-622 inhibitor 轉染后細胞中miR-622 表達水平及細胞增殖情況 miR-622 inhibitor 組中miR-622 相對表達量為（0.53±0.07），低于control 組的（1.05±0.06）及miR-NC 組的（1.03±0.10），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1；CCK-8 實驗結果顯示，12 h 后，miR-622 inhibitor 組（0.41±0.23）增殖能力低于control 組（0.58±0.33）及miR-NC 組（0.55±0.31），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖1 各組細胞中miRNA-622 的表達情況

圖2 CCK-8 實驗檢測各組乳腺癌細胞中的增殖能力

2.2 miR-622 inhibitor 轉染后細胞遷移情況 miR-622 inhibitor 組遷移率（21.31±6.91）%低于control組（39.89±9.32）%及miR-NC 組（32.47±7.82）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 細胞劃痕試驗測定各組乳腺癌細胞中的遷移能力

2.3 miR-622 inhibitor 轉染后細胞侵襲情況 control組（160.33±11.93）及miR-NC 組（160.33±11.02）侵襲細胞數(shù)高于miR-622 inhibitor 組的（125.00±11.53），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 Transwell 實驗檢測各組中乳腺癌細胞中的侵襲能力情況

2.4 miR-622 inhibitor 轉染后細胞中EYA1 表達水平 Western blot 研究結論顯示，miR-622 inhibitor組細胞EYA1 蛋白相對表達水平為（3.77±0.27），高于control 組的（1.04±0.04）和miR-NC 組的（0.97±0.07），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示miR-622可能調控EYA1 的表達，其中miR-622 呈負向調控，見圖5。

圖5 Western blot 檢測各組EYA1 蛋白的表達水平

3 討論

乳腺癌是全世界女性因癌癥致死的最常見原因，對乳腺癌的診療技術的探討仍是一大熱點。雖然目前通過手術切除、新輔助化療、放療、中醫(yī)和靶向治療等綜合方法，乳腺癌的發(fā)展得到一定緩解，但5 年總生存率仍然較低[1]。因此迫切需要了解乳腺癌的分子發(fā)病機制，從分子水平探討治療乳腺癌的可能性以及開發(fā)用于靶向治療藥物，對乳腺癌進行精準治療，提高患者生存率。miRNA 對腫瘤的調控作用越來越受到重視[7]。既往研究表明[8，9]，miRNA 影響了癌細胞的增值、轉移與侵襲，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移密切相關。

miRNA 與靶基因信使RNA（mRNA）結合來調節(jié)mRNA，從而影響生命活動，參與疾病的發(fā)生發(fā)展[3]。既往研究顯示[10]，miR-622 位于人染色體13q31.3 區(qū)域，在多種腫瘤中異常表達，靶向調節(jié)不同信號通路在多種癌癥中發(fā)揮作用。但有關miR-622 在乳腺癌中的參與機理的研究甚少。本研究采用了在乳腺癌細胞中轉染miR-622 inhibitor 下調癌細胞中miR-622 后發(fā)現(xiàn)，與control 組以及miRNC 組比較，miR-622 inhibitor 組中癌細胞增殖、遷移和侵襲力均顯著減弱這一現(xiàn)象，并由此證明了miR-622 的表達可以參與乳腺癌細胞的生長過程，抑制miR-622 表達可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲從而參與了抑制乳腺癌細胞轉移的進程。此研究中提示miR-622 在乳腺癌的增殖、遷移和侵襲中起促進作用。魏晰麟等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在結腸癌中miR-622 表達是升高的，促進miR-622 的表達水平后可下調DYRK2 表達并使得SW1116 細胞侵襲轉移作用增強。李仲均等[11]研究顯示，miR-622 在卵巢上皮性癌組織中表達增高可能發(fā)揮促癌作用。說明miR-622 確實可通過影響某些通路而促進癌癥的轉移與發(fā)展，產生促癌作用。然而有研究結果顯示miR-622 的表達在膠質母細胞瘤、甲狀腺乳頭狀癌等癌癥中上調。Wang X 等[8]的研究，在膠質母細胞瘤的進展中，增高的miR-622 抑制K-Ras 的表達從而發(fā)揮了遏制癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用。通過靶向調節(jié)c-Myc，miR-622過度表達抑制膽管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，而抑制miR-622 則產生相反的結果[9]。上述研究中提示上調miR-622 可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，而抑制miR-622 可減弱這一作用。Orlandella FM 等[4]及Liu C 等[5]的研究顯示，高表達miR-622 抑制乳腺癌細胞的轉移，本研究結果與上述研究存在差異，可能通過不同的信號通路以及與不同的分子協(xié)作或拮抗發(fā)揮不同的作用有關。miR-622 家族對促進或抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用方面的研究存在不同意見。

為了進一步研究miR-622 調控乳腺癌細胞的機制，本研究根據(jù)生物信息學，尋找到EYA1 基因與miR-622 具有結合位點，用Western blot 檢測了miR-622 inhibitor 轉染后細胞中EYA1 表達水平，試圖尋找EYA1 基因與miR-622 存在關聯(lián)的證據(jù)。EYA1 即“果蠅眼缺失”基因，是與果蠅眼睛形態(tài)發(fā)育有關的重要調控因子[12]。在人類身上，EYA 基因家族的缺失或突變，會造成一種常染色體顯性遺傳性疾病，即鰓-耳-腎綜合征，該病以腎臟發(fā)育異?；蛉笔АⅥw裂發(fā)育異常、耳前瘺管以及聽力損失為特征[13-15]。近年來，有關EYA1 在各種腫瘤惡性進展中的作用機制的研究得到大量關注。然而有關EYA1 在乳腺癌中的作用機制的研究報道較少，本研究在乳腺癌細胞中轉染miR-622 抑制物后發(fā)現(xiàn)EYA1 表達增高，說明抑制miR-622 表達可上調EYA1 的水平，結果提示miR-622 可能負調控EYA1 的表達。在本研究中，抑制miR-622 表達可能對癌細胞增殖起削弱作用，同時EYA1 的表達水平升高，實驗提示miR-622 水平降低有可能通過調控EYA1 來實現(xiàn)對乳腺癌細胞增殖的抑制作用。在本研究中，EYA1 可能起抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲的作用，而在某些研究中EYA1 卻扮演著促癌基因的角色。Kong D 等[16]發(fā)現(xiàn)在肝細胞癌中，EYA1與侵襲性以及不良預后有明顯的關聯(lián)，研究顯示在肝細胞癌中EYA1 的表達提高，并且可使得肝癌細胞的遷移和侵襲作用加強。Cai S 等[17]探究結直腸癌中的發(fā)病機理時，發(fā)現(xiàn)EYA1 表達水平增高可誘導促進結直腸癌轉移。且Guan H 等[18]的研究探討了EYA1 在乳腺癌中的作用，結果提示靶向下調EYA1 減弱了乳腺癌細胞的增殖作用。在癌癥發(fā)生機制中，一般存在多種因素相互作用產生抑癌或促癌效果，EYA1 在乳腺癌中的具體作用仍是需要研究的方向，目前尚無實驗證據(jù)證明miR-622 是否與EYA1 存在結合位點，且miR-622 下調EYA1 是否在乳腺癌的發(fā)病機制中發(fā)揮效果以及可能存在的具體信號通路仍有待進一步探討。

綜上所述，上述研究提示抑制miR-622 的表達后可抑制乳腺癌的增殖、侵襲與遷移，抑制乳腺癌的轉移，miR-622 是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，為乳腺癌基因治療提供了新的靶點并且可作為靶向藥物開發(fā)的新方向，促進腫瘤精準治療。并且miR-622 可能負調控EYA1 發(fā)揮作用，然而miR-622 調控EYA1 的機制以及上下游通路仍有待進一步探索，為以后有關乳腺癌的實驗研究提供了新思路。