超臨界?超聲輔助提取煙葉中的煙油和多酚

張 花，顧麗莉**，李增良，唐徐禹，彭 健，黃智華，李江舟，張立猛

(1. 昆明理工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，云南昆明 650500；2. 云南省煙草公司 玉溪市公司，云南玉溪 653100)

煙草，茄科煙草屬植物，一年生或有限多年生草本植物，葉矩圓狀披針形，頂端漸尖，原產(chǎn)于南美洲，中國南北各省區(qū)廣為栽培. 云南約有40%的土地面積屬于烤煙種植最適宜區(qū)，是中國規(guī)模最大的“兩煙”生產(chǎn)基地，其煙葉生產(chǎn)量約占全國總產(chǎn)量的1/3[1]，對中國農(nóng)產(chǎn)品財政收入貢獻較大[2]. 多酚類物質(zhì)是煙葉中一種重要的次生代謝產(chǎn)物，也是煙氣香味的重要前體物質(zhì)之一. 煙葉中的多酚主要包括黃酮類 (蘆丁) 、單寧類 (綠原酸) 以及香豆素類物質(zhì) (莨菪靈、莨菪亭、七葉亭) 等，其中綠原酸、蕓香苷 (蘆丁) 和莨菪亭是煙葉中最主要的多酚，且綠原酸可占多酚總量的75%～95%[3]. 多酚類物質(zhì)的種類及含量對煙葉色澤、卷煙香氣、卷煙吸味有著重要影響，是評估煙草制品品質(zhì)的重要指標[4-5].所以，有效提取分離并研究煙葉中的多酚類物質(zhì)，將其應(yīng)用到食品、醫(yī)藥保健[6-8]等領(lǐng)域，不僅能提高煙草相關(guān)產(chǎn)品的品質(zhì)，而且能增加煙草制品的經(jīng)濟利用價值.

一直以來，煙油的分離是煙葉有效成分提取的重要方向，超臨界萃取方法的零溶劑殘留優(yōu)勢使其應(yīng)用越來越廣泛，對煙葉煙油的提取也不例外[9]，但人們卻忽視了經(jīng)過超臨界萃取之后煙葉的再利用價值. 實際上，超臨界萃取后的煙葉中仍含有大量活性物質(zhì)（如多酚和黃酮類化合等），值得進一步加以利用. 本研究按照圖1 路線分別探究了超聲提取法、超臨界萃取法以及超臨界-超聲輔助提取法所得煙油、多酚和其他主要成分的差異，結(jié)果表明，超臨界-超聲輔助提取法所得煙油及多酚的得率優(yōu)于超聲提取法和超臨界萃取法.

圖1 實驗路線Fig. 1 The experimental route

1 實驗部分

1.1 樣品、試劑與儀器 樣品：云南省元江C3F 初烤煙葉，品種K326.

試劑：無水乙醇、乙酸乙酯，分析純，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；丙酮，分析純，成都市科龍化工試劑廠；沒食子酸標品（純度ω=99%）、福林酚試劑，上海麥克林生化科技有限公司；無水碳酸鈉，分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；無水甲醇，分析純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；綠原酸標品（純度ω=95%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蕓香苷（蘆?。?，純度ω=98%，北京百靈威科技有限公司；莨菪亭（東莨菪內(nèi)酯）、咖啡酸、槲皮素、山奈酚，純度ω≥98%，北京索萊寶科技有限公司；娃哈哈飲用純凈水，衡陽娃哈哈恒楓飲料有限公司.

主要儀器：SFE-500 型超臨界CO2萃取儀，Thar 科技公司；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；KQ-250DE 型數(shù)控超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司；Agilent 1290/6460 型液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS），德國安捷倫科技有限公司；7890A-5975C 型氣質(zhì)聯(lián)用設(shè)備（GC-MS），德國安捷倫科技有限公司；BSA224S 型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；RHP-600 型高速多功能粉碎機，浙江榮浩工貿(mào)有限公司；UV-2550 型紫外可見分光光度計，日本島津公司；蔡司Gemini300 掃描電鏡，德國蔡司公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲輔助提取 通過查閱相關(guān)文獻[10]及初步實驗探究，分別選用甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯、丙酮以及醇類的水溶液作為萃取植物中多酚類物質(zhì)的溶劑，并通過對比不同溶劑的提取效果選出最佳溶劑. 根據(jù)課題組前期研究并結(jié)合相關(guān)文獻[11-12]，按照表1 設(shè)計四因素三水平的正交實驗，探究超聲提取初烤煙葉中煙油及多酚的最佳工藝條件.

表1 超聲輔助提取正交實驗方案Tab. 1 Orthogonal experimental scheme for ultrasoundassisted extraction

1.2.2 超臨界CO2流體萃?。⊿FE） 采用本課題組前期研究結(jié)果[13]，從初烤煙葉超臨界萃取煙油的最佳條件為：萃取壓力25 MPa、萃取溫度50 ℃、CO2流量20 g/min 和萃取時間120 min.

1.2.3 超臨界-超聲輔助提取 以經(jīng)過超臨界萃取（條件同1.2.2 節(jié)）之后的煙葉為原料，采用1.2.1中所選最佳溶劑和表1 的正交實驗方案，探究超聲輔助提取上述原料中煙油及多酚的最佳工藝條件.

1.2.4 煙油及多酚提取率的計算方法式中：m1為煙油質(zhì)量，g；m2為煙油中總多酚的質(zhì)量，由公式（2）得到，g；mi為煙油中某種多酚i的質(zhì)量，g；m總為煙葉原料質(zhì)量，g；ρ為通過液質(zhì)檢測得到多酚的質(zhì)量濃度，g/mL；V為樣品液定容體積，mL；n為提取液的稀釋倍數(shù).

1.3 多酚的測定

1.3.1 總多酚含量的測定 采用福林酚比色法[14-16]測定煙葉中的總多酚含量，配制沒食子酸標準溶液，用紫外分光光度計于760 nm 波長處測其吸光度值. 沒食子酸質(zhì)量濃度x(公式（2）中的ρ)為橫坐標，吸光度值y為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線，得到標準曲線方程（6），其相關(guān)系數(shù)為R2=0.996 7.

1.3.2 每種多酚化合物的定性定量檢測[17]采用高效液相色譜-質(zhì)譜檢測提取煙油中的各種多酚含量. 高效液相色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（ φ4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫為30 ℃；流速為0.2 mL/min；進樣量為1 μL；流動相A 為0.1 %甲酸水溶液，流動相B 為甲醇，按表2 條件梯度洗脫. 質(zhì)譜條件：電噴霧離子（ESI）源，正離子模式；毛細管電壓4 000 V；干燥氣流速10.0 L/min，干燥氣溫度300 ℃；霧化器壓力413.69 kPa；采集模式為多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）采集. 通過公式（4）計算mi.

表2 流動相梯度洗脫程序Tab. 2 Mobile phase gradient elution procedure

1.3.3 煙油成分的測定 采用氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜（GC-MS）檢測所得煙油成分. 氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS (30 m× φ0.25 mm，0.25 μm)；進樣溫度250 ℃；程序升溫：柱溫 80 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至200 ℃，保持3 min，最后以8 ℃/min 升至280 ℃，保持10 min；He 載氣，流量1.0 mL/min；分流進樣，分流比為50∶1，進樣體積0.2 μL. 質(zhì)譜條件：EI 離子源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；電離能70 eV，全離子掃描檢測質(zhì)量數(shù)范圍50～550 ，溶劑延遲3 min.

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取煙油及多酚 分別以甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯、丙酮以及50 %乙醇為溶劑，超聲提取煙葉中的煙油及多酚，不同溶劑的提取效果如圖2、3 所示. 其中，圖2 以煙油得率為縱坐標，圖3 以煙油中6 種多酚（綠原酸、蕓香苷（蘆?。?、咖啡酸、槲皮素、莨菪亭、山奈酚）的得率為縱坐標. 從圖2、3 中可以看出，以50%乙醇作溶劑時提取效果最好. 醇類水溶液對多酚物質(zhì)的提取效果較好，后期可通過改變醇的體積分數(shù)調(diào)整溶劑的極性尋找更優(yōu)溶劑；另外，乙醇的沸點低，在旋蒸時利于除去，可減少溶劑殘留，并且乙醇溶液相對于其他有機溶劑對人體更加安全，符合煙草吸食制品的安全性要求，故后續(xù)實驗中優(yōu)選不同體積分數(shù)的乙醇水溶液作溶劑.

圖2 不同溶劑所提取煙油含量的差異Fig. 2 Difference of contents of tobacco oil extracted by different solvents

圖3 不同溶劑所提取多酚含量的差異Fig. 3 Difference of contents of polyphenols extracted by different solvents

通過正交實驗優(yōu)化（見表3）所得超聲提取煙葉中煙油及多酚的最佳條件為：以60%乙醇為溶劑，超聲溫度60℃，超聲功率200 W，超聲時間40 min.該條件下以元江K326/C3F 初烤煙葉為原料進行驗證性實驗，所得煙油得率為61.07%；6 種多酚提取率為1.74%；總多酚提取率為3.22%. 所得煙油經(jīng)GC-MS 檢測，其中含量較高的主要為煙堿、新植二烯、戊酸、1，5，9-三甲基-12-（1-甲基乙基）-4，8，13-環(huán)四十三碳三烯-1，3-二醇.

表3 超聲輔助提取初烤煙葉多酚的正交實驗結(jié)果Tab. 3 Orthogonal experiment results on ultrasonic-assisted extraction of polyphenols from primary flue-cured tobacco leaves

2.2 超臨界CO2流體萃取煙油及多酚 根據(jù)本課題組前期研究，超臨界萃取初烤煙葉中煙油得率最高可達3.20%，GC-MS 檢測其主要成分為煙堿、新植二烯、（Z，Z，Z）-9，12，15-十八碳三烯酸、維生素E、正十六烷酸等[13]. 紫外分光光度計檢測并計算煙油中總多酚提取率僅為0.000 2%，表明超臨界萃取煙油中多酚含量極少. 文獻報道[18]表明，不同來源煙草多酚類物質(zhì)的含量變化范圍較寬，一般占煙葉質(zhì)量的0.52%～6.04%；不同基因型烤煙中多酚的平均質(zhì)量分數(shù)一般為3.21%[19]，說明多酚化合物仍保留于超臨界萃取后的煙葉中，故對經(jīng)過超臨界萃取之后煙葉中的煙油和多酚進行超聲輔助提取.

2.3 超臨界?超聲輔助提取煙葉中的煙油和多酚以經(jīng)過超臨界萃取（條件同1.2.2 節(jié)）之后的煙葉廢料為原料，通過正交實驗優(yōu)化（表4）得到超聲輔助提取煙油及多酚的最佳條件為：以60%乙醇為溶劑，超聲溫度50 ℃，超聲功率200 W，超聲時間30 min. 驗證實驗表明，該條件下煙油的平均得率可達67.5%，6 種多酚提取率可達2.51%，總多酚提取率可達3.15%. GC-MS 檢測煙油的主要組分為煙堿、氟乙酸甲酯、雙（乙烯砜甲基）醚、環(huán)丙烷-二甲酰、2，4-二-叔丁基苯酚、n-丙氧羰基-乙酯、D-脯氨酸，n-甲氧羰基-戊酯、5，6-癸烷酯、3，4-二甲基-1，2，5-噁二唑、鄰苯二甲酯、二氟胺和6-氮雜尿嘧啶.結(jié)果證明，超臨界萃取所得煙油和超聲提取初烤煙葉中煙油的成分主要為烴類及烴的衍生物；超臨界-超聲輔助提取所得煙油中多酚和雜環(huán)化合物種類較多，說明超臨界萃取過程對下一步超聲提取煙葉中的更多活性物質(zhì)創(chuàng)造了條件.

表4 超聲輔助提取煙葉廢料中的多酚正交實驗Tab. 4 Orthogonal experiment of ultrasonic-assisted extraction of polyphenols from tobacco waste

按照表1 的正交實驗方案，分別比較超聲輔助提取、超臨界-超聲輔助提取兩種方法在9 組條件下所得煙油及多酚的差異，實驗結(jié)果如圖4、5 所示. 超臨界-超聲輔助提取煙油及多酚的得率均高于超聲輔助提取，表明超臨界萃取過程具有強化作用，該作用有益于后期的超聲輔助提取，為此，對超臨界萃取前后的初烤煙葉0.28 mm(60 目)粉末和1 cm2碎片進行了形貌表征.

圖4 超聲提取與超臨界?超聲輔助提取所得煙油含量差異Fig. 4 Differences in the contents of tobacco oil extracted from ultrasonic extraction and supercritical ultrasonicassisted extraction

圖5 超聲提取與超臨界?超聲輔助提取所得多酚含量差異Fig. 5 Differences in the contents of polyphenols extracted from ultrasonic extraction and supercritical ultrasonicassisted extraction

圖6 和圖7 分別為超臨界前后0.28 mm(60 目)煙末和1 cm2煙葉碎片的掃描電鏡形貌圖，比較圖6（a）與圖6（b），圖7（a）與圖7（b）可見，初烤煙葉原料經(jīng)過超臨界CO2流體的作用，恢復(fù)常壓后，煙葉表面組織被破壞，致使煙葉深層的纖維組織得以暴露，打開了多酚物質(zhì)及其他組分溶出的更多通道，使溶劑分子與煙葉組分的接觸面大大提高，促使多酚物質(zhì)和其他組分更容易被溶出. 故而在隨后的超聲提取中，從煙葉中可更多地提取得到煙油和多酚化合物，驗證了超臨界萃取不僅可作為一種提取分離技術(shù)，也可作為一種有效的前期輔助手段，為下一步提取創(chuàng)造條件，能更好地提高煙葉原料的利用率，增加其附加值. 幾種提取工藝的結(jié)果匯總于表5 中.

圖6 煙葉粉末的外觀形貌（×2 500）Fig. 6 The appearance morphology of tobacco powder

圖7 煙葉碎片的外觀形貌（×250）Fig. 7 The appearance morphology of tobacco leaf fragments

表5 最佳條件下3 種提取路線的結(jié)果匯總Tab. 5 Summarization of the results of three extraction routes under optimal conditions

3 結(jié)論

本實驗分別探究了超聲提取法、超臨界萃取法以及超臨界-超聲輔助提取法從煙葉中提取煙油得率和多酚以及其他主要成分的差異. 結(jié)果表明，超臨界-超聲輔助提取法所得煙油及多酚的得率優(yōu)于超聲提取法和超臨界萃取法，證明前期超臨界萃取過程使煙葉深層纖維組織得以裸露，能打開多酚物質(zhì)及其他組分溶出的更多通道，為后期煙油及多酚的高效提取創(chuàng)造良好條件. 同時，本研究中超臨界-超聲輔助提取煙葉中的煙油和多酚工藝可得到以煙堿含量為主的零溶劑煙油，能為進一步分離純化煙堿提供原料儲備，極好地提高了煙葉原料的利用率及其附加值，并且該方法操作成本較低，易于工業(yè)化生產(chǎn).