基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討清化腸飲治療潰瘍性結(jié)腸炎作用機(jī)制

韓育英，曹劉菁，柯 曉，彭 軍，沈阿靈*，陳友琴，4*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；4.美國(guó)凱斯西儲(chǔ)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，俄亥 俄州克利夫蘭 44106）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因不明的直腸和結(jié)腸慢性非特異性炎癥性疾?。?］，其在北美洲和歐洲的發(fā)病率分別為24.3/10 萬(wàn)和19.2/10 萬(wàn)，在我國(guó)乃至亞洲地區(qū)，UC 發(fā)病率也呈明顯上升趨勢(shì)［2］，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確，一般認(rèn)為是遺傳、環(huán)境、腸道菌群、免疫應(yīng)答等多種因素相互作用的結(jié)果［3-4］。目前治療UC 臨床常用藥以糖皮質(zhì)激素、水楊酸制劑、免疫抑制劑為主［5］，盡管這些藥物短期療效良好，但長(zhǎng)期使用存在一定的毒副作用［6］，因此，尋找更加安全有效的UC 治療藥物顯得尤為重要。

中醫(yī)學(xué)對(duì)UC 病名雖無(wú)記載，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，認(rèn)為UC 屬“泄瀉”“久痢”“腸癖”等范疇，病機(jī)以脾腎虧虛為本虛，以濕熱、瘀血、熱毒為標(biāo)實(shí)［7］。劉河間在《素問(wèn)玄機(jī)原病式》指出：“諸瀉痢皆屬于濕，濕熱甚于腸胃之內(nèi)，而腸胃怫郁，以致氣液不得宣通而成”［8］，可見(jiàn)，濕熱在UC 發(fā)病中占有重要地位。清化腸飲（QHCY）是國(guó)醫(yī)大師楊春波教授治療UC 大腸濕熱證的經(jīng)驗(yàn)方，由仙鶴草、地榆、黃連、赤芍、白豆蔻、厚樸、茵陳、佩蘭、薏苡仁、白扁豆、茯苓11 味藥組成，具有清熱化濕、收斂止血、止痢、瀉火解毒、健脾的功效［9］，臨床研究證實(shí)QHCY 治療濕熱型UC 療效確切［10］。前期基礎(chǔ)研究表明：QHCY 能夠通過(guò)抑制UC 相關(guān)炎性因子的分泌以緩解炎癥，維持腸上皮細(xì)胞的緊密連接水平以修復(fù)腸黏膜機(jī)械屏障［11-12］。然而，QHCY 在UC 治療中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明，因此，本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)和揭示QHCY 治療UC 作用機(jī)制。

1 方 法

1.1 QHCY活性成分收集與篩選 采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）［13］，在“herbname”檢索框中分別以“仙鶴草”“地榆”“黃連”“赤 芍”“白豆 蔻”“厚 樸”“茵陳”“佩蘭”“薏 苡仁”“白扁豆”“茯苓”為檢索詞，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30% 和 類(lèi) 藥 性（druglikeness，DL）≥0.18 作為篩選依據(jù)［14］，篩選出11 味中藥活性成分信息。

1.2 QHCY 的作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的QHCY 活性成分進(jìn)行蛋白靶標(biāo)獲取，然后將獲得的蛋白靶標(biāo)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.Uniprot.org/），轉(zhuǎn)化成統(tǒng)一的基因名，設(shè)置基因來(lái)源為人源性，從而獲得QHCY 活性成分的作用靶點(diǎn)［15］。

1.3 QHCY 治療UC 作用靶點(diǎn)的收集 在DisGeNET數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//www.disgenet.org/）［16］和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）［17］中以“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞，檢索UC 的靶點(diǎn)，去除重復(fù)項(xiàng)后，與QHCY 活性成分的作用靶點(diǎn)相映射，得到QHCY 治療UC 的共同靶點(diǎn)，即作用靶點(diǎn)。

1.4 活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與QHCY 治療UC 關(guān)鍵活性成分的獲取 將共同靶點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的活性成分導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2 軟件中，構(gòu)建出活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，并導(dǎo)出相關(guān)拓?fù)鋽?shù)據(jù)，篩選大于平均度值（degree）的節(jié)點(diǎn)，得到QHCY 治療UC 的關(guān)鍵活性成分。

1.5 構(gòu)建靶點(diǎn)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖 將QHCY 與UC 的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)置為“homo sapiens”，設(shè)定置信度＞0.9，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲取相互作用關(guān)系信息表。將表中數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制共同靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，同時(shí)對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，確定QHCY 治療UC 的核心靶點(diǎn)［18］。

1.6 GO 和KEGG 富集分析 將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，以P＜0.001 作為篩選條件，并且依據(jù)富集通路涉及基因數(shù)的大小，從大到小進(jìn)行排名，篩選出KEGG 富集分析中排名前20 名的通路及GO 富集分析中排名前10 名的條目。

2 結(jié) 果

2.1 QHCY 活性成分及其作用靶點(diǎn) 運(yùn)用TCMSP分析平臺(tái)，篩選出不重復(fù)而且有作用靶點(diǎn)的活性成分75 個(gè)，其中仙鶴草5 個(gè)，地榆9 個(gè)，黃連11 個(gè)，赤芍14 個(gè)，白豆蔻14 個(gè)，厚樸3 個(gè)，茵陳13 個(gè)，佩蘭7個(gè)，薏苡仁6 個(gè)，白扁豆1 個(gè)，茯苓6 個(gè)，見(jiàn)表1。利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)確定了不重復(fù)的靶點(diǎn)共計(jì)241 個(gè)，見(jiàn)表1。

表1 QHCY 活性成分信息

續(xù)表1

2.2 QHCY 治療UC 的作用靶點(diǎn) 通過(guò)檢索得到UC 疾病作用靶點(diǎn)5 168 個(gè)，將QHCY 活性成分作用靶點(diǎn)與UC 疾病作用靶點(diǎn)相映射，得到二者共同靶點(diǎn)167 個(gè)。

2.3 活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖分析結(jié)果 活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中共涉及230 個(gè)節(jié)點(diǎn)（即共同作用靶點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)活性成分的節(jié)點(diǎn)）和608 條節(jié)點(diǎn)連接線（連接線表示兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間存在相互作用），見(jiàn)圖1。由圖1 可知：QHCY 治療UC 并非單一成分或單一靶點(diǎn)的作用，而是多成分、多靶點(diǎn)的聯(lián)合作用?；钚猿煞止?jié)點(diǎn)的平均度值（度值表示某一個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的連接數(shù)，度值越大，連接的節(jié)點(diǎn)數(shù)越多）為9.650 794，其中有19 個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)的度值高于平均值，為QHCY 治療UC 的潛在關(guān)鍵活性成分，見(jiàn)表2。

圖1 QHCY 活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表2 QHCY 治療UC 關(guān)鍵活性成分信息

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析結(jié)果 PPI網(wǎng)絡(luò)圖中共有146個(gè)節(jié)點(diǎn)（即共同作用靶點(diǎn)），705 條節(jié)點(diǎn)連接線。將在String 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，節(jié)點(diǎn)平均度值為9.657 534，其中轉(zhuǎn)錄因子1（JUN）、腫瘤抗原p53（TP53）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、轉(zhuǎn)錄因子p65（RELA）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、腫瘤壞死因子（TNF）、原癌基因蛋白（FOS）、連環(huán)蛋白β1（CTNNB1）、白介素-6（IL6）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）等61個(gè)節(jié)點(diǎn)度值高于平均值，即為QHCY 治療UC 的核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

圖2 QHCY 共同靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 富集分析 GO 富集分析顯示涉及生物過(guò)程（BP）214 個(gè)，細(xì)胞組分（CC）22 個(gè)，分子功能（MF）39 個(gè)，將排名前10 名的GO 條目繪制柱狀圖，見(jiàn)圖3。

圖3 共同靶點(diǎn)的GO 富集分析圖

2.6 KEGG 通路分析 經(jīng)篩選得到87 條信號(hào)通路，且根據(jù)富集通路涉及基因數(shù)的大小，由大到小進(jìn)行排名，篩選出排名前20 名的通路，見(jiàn)表3。

表3 KEGG 信號(hào)通路富集分析結(jié)果（前20 名）

3 討 論

QHCY 活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中共篩選出19個(gè)關(guān)鍵活性成分，包括槲皮素、木犀草素、山柰酚等。槲皮素的綜合評(píng)分高于其他活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎等多種藥理作用［19］，可通過(guò)抑制炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 的釋放和增強(qiáng)結(jié)腸抗氧化活性來(lái)發(fā)揮治療UC 的作用［20］；木犀草素屬于黃酮類(lèi)化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化和抗菌等多種藥理作用［21］，可通過(guò)抑制UC 大鼠結(jié)腸NF-κB、IL-17 和IL-23 的水平，調(diào)節(jié)腸道菌群，從而減少UC 大鼠結(jié)腸損傷［22］；山柰酚是黃酮醇類(lèi)化合物的代表成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、提高機(jī)體免疫力等多種功能［23］，可通過(guò)下調(diào)UC 小鼠血清中一氧化氮與前列腺素E2的水平，增強(qiáng)杯狀細(xì)胞分泌黏液的功能，從而起到減輕腸黏膜損傷的作用［24］。由此可見(jiàn)，QHCY 篩選出來(lái)的活性成分普遍具有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等功能，這可能是其治療UC 的主要藥理作用。

通過(guò)對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖分析得出61 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，在這些靶點(diǎn)中排名靠前且與UC 關(guān)系密切的靶點(diǎn)有JUN、TP53、AKT1、RELA 等。JUN 作用于AP-1（c-JUN）信號(hào)通路上，在炎性細(xì)胞增殖、分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)與細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)的分泌有關(guān)［25］；TP53 是目前發(fā)現(xiàn)的一種重要的抑癌基因［26］，在UC 發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，但已有研究表明TP53 可作為UC 患者中結(jié)腸異型增生和結(jié)腸癌篩查的生物指標(biāo)，可能是治療UC 相關(guān)性結(jié)直腸癌患者的潛在靶標(biāo)［27］；AKT1 具有調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、分化及代謝等功能［28］，有研究表明活化的AKT 可以促進(jìn)NF-κB 的磷酸化，抑制IκB的蛋白合成而激活NF-κB，進(jìn)而增加TNF-α、IL-1β 等炎性細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄，造成細(xì)胞因子IL-6、IL-8 的失衡，進(jìn)而產(chǎn)生腸黏膜損傷［29］；RELA 作為NF-κB 的一個(gè)蛋白質(zhì)亞單位，其翻譯后修飾可以調(diào)控NF-κB 的轉(zhuǎn)錄激活，并在炎癥反應(yīng)相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［30］。

通過(guò)KEGG 富集分析可知：QHCY 主要通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt、TNF、MAPK、Toll 樣受體、HIF-1 等多種信號(hào)通路而達(dá)到治療UC 的作用，這些通路與免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。PI3K/Akt 信號(hào)通路可通過(guò)激活NF-κB 這一經(jīng)典炎癥通路來(lái)調(diào)控免疫和炎癥反應(yīng)［31］；TNF 主要由巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等細(xì)胞分泌，參與炎癥因子生成、白細(xì)胞募集、炎性介質(zhì)合成等過(guò)程［32］；MAPK 信號(hào)通路的下游包括p38、c-Jun N 端激酶（JNK）與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）等信號(hào)通路，MAPK 通路的活化可使其下游的p38、JNK 和ERK磷酸化，引起細(xì)胞增殖、分化及凋亡等，進(jìn)而參與炎癥反應(yīng)［33］；Toll 樣受體是最早發(fā)現(xiàn)的信號(hào)分子識(shí)別受體，可以通過(guò)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子、趨化因子和干擾素的分泌參與炎癥反應(yīng)［34-35］；HIF-1 是應(yīng)答缺氧應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥疾病的發(fā)病過(guò)程中高表達(dá)［36］。有研究表明：在UC 模型大鼠結(jié)腸黏膜中HIF-1、VEGF 含量增高，進(jìn)一步佐證了UC 的發(fā)生、發(fā)展與免疫失調(diào)和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［37］。

綜上所述，本研究結(jié)果表明QHCY 可能是通過(guò)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等多種途徑發(fā)揮治療UC 的作用。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)了QHCY 治療UC 的關(guān)鍵活性成分、核心靶點(diǎn)和信號(hào)通路，對(duì)QHCY 治療UC 的分子機(jī)制研究提供了參考，但由于本研究?jī)H基于數(shù)據(jù)挖掘和分析，因此QHCY 對(duì)UC 治療作用的分子機(jī)制仍需通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。