歸脾湯對(duì)慢性睡眠剝奪大鼠HPA軸功能及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

張 敏，黃俊山，張一帆，曾雪愛(ài)，王秀峰，陳銘奇，張 婭

（1.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福建 福州 350003；2.福建省中醫(yī)睡眠醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003；3.黃俊山福建省名老中醫(yī)藥專家傳承工作室，福建 福州 350003）

慢性失眠發(fā)生與下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）及腦內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)密切相關(guān)，病情大多反復(fù)難愈，根治困難。歸脾湯（Gui Pi Decotion，GPD）是臨床治療心脾兩虛型失眠的經(jīng)典方，廣泛應(yīng)用于臨床，但其治療慢性失眠的機(jī)制尚不明確。HPA 軸是最原始的內(nèi)源性晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和皮質(zhì)醇（CORT）是HPA 軸重要的組成激素，與睡眠密切相關(guān)［1］。HPA 軸能調(diào)控腦內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)，其失?？蓪?dǎo)致單胺類遞質(zhì)如5-羥色胺（5-HT）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA）等的改變。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改良水平臺(tái)法建立大鼠慢性睡眠剝奪模型，探討GPD 對(duì)CRH、ACTH 和CORT 以及5-HT、5-HIAA、NE、DA 含量的影響。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠48 只，8～9 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK（滬）2018-0006，在福建省中醫(yī)藥科學(xué)院比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)1 周。飼養(yǎng)環(huán)境安靜，恒溫（22±1）℃，每日12 h 固定照明（8：00 開(kāi)燈），并可自由攝取食物和水，合格證號(hào)為SYXK（閩）2016-0005。本實(shí)驗(yàn)獲得福建省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：FJATCMIAEC2020010）。

1.2 藥物與主要試劑 人參、木香、遠(yuǎn)志、當(dāng)歸、白術(shù)、茯神、黃芪、龍眼肉、炒酸棗仁、炙甘草（福建省鷺燕醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：190601、1907028077、190901、190515、1905018082、190901、190522、190808、190620、190820-010）；艾司唑侖（濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：20200501）；CRH、ACTH、CORT 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國(guó)Trust Specialty Zeal公司，型號(hào)：RG-28912、R6404、RG18882）；水合氯醛（北京雷根生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：R00635）；5-HT、5-HIAA、NE、DA 試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：B21833、B27047、B24713、B25300）。

1.3 主要儀器 Rayto RT-6100 酶標(biāo)分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；Rigol L3000 高效液相色譜儀（普源精電科技股份有限公司）；Kromasil C18 反相色譜柱（荷蘭Nouryon 公司）。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 GPD 藥液的制備 稱取人參10 g，木香10 g，遠(yuǎn)志10 g，當(dāng)歸10 g，白術(shù)20 g，茯神20 g，黃芪20 g，龍眼肉20 g，炒酸棗仁20 g，炙甘草5 g。先量取10倍總量冷水浸泡30 min，武火煮沸后文火繼續(xù)煮20 min，過(guò)濾，收集濾液；次煎再加冷水沒(méi)過(guò)中藥，武火煮沸后文火繼續(xù)煮30 min，過(guò)濾。將兩份濾液合并，濃縮至1.86 g/mL GPD 藥液。將藥液與蒸餾水分別按1∶1及1∶3稀釋，可得0.93 g、0.47 g/mL GPD 藥液。

2.1.2 大鼠慢性睡眠剝奪模型制備 將48 只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組8 只及造模組40 只，造模組大鼠均通過(guò)改良水平臺(tái)法進(jìn)行慢性睡眠剝奪。參考文獻(xiàn)［2］，造模組大鼠每天（16：00—次日10：00）睡眠剝奪18 h，次日（10：00—16：00）放回籠內(nèi)休息6 h，實(shí)驗(yàn)周期為21 d。正常對(duì)照組采用大平臺(tái)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，不進(jìn)行任何處理，標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)。若大鼠出現(xiàn)白天活動(dòng)增加，夜間慵懶喜臥，晝夜節(jié)律紊亂，喜靜少動(dòng)，飲食減少，體質(zhì)量降低，反應(yīng)遲鈍，時(shí)有焦慮易激惹現(xiàn)象，較正常對(duì)照組明顯不同，提示模型制備成功［2］。

2.1.3 分組與給藥 除正常對(duì)照組外，將造模成功的大鼠按分層隨機(jī)分組方法分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組及艾司唑侖組，每組8 只。造模第15 天，低、中、高劑量組分別以0.47、0.93、1.86 g/mL GPD（相當(dāng)于臨床人日用量的3、6、12倍），艾司唑侖組以0.009 mg/mL 艾司唑侖（相當(dāng)于人臨床日用量的6倍），正常對(duì)照組及模型組以生理鹽水，均按1 mL/100 g 體質(zhì)量灌胃。每天1 次，連續(xù)7 d。

2.1.4 組織標(biāo)本的采集 造模后21 d 給藥后開(kāi)始禁食、禁水，24 h 之后用戊巴比妥鈉（1 mL/100 g）麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血；后斷頭，剪開(kāi)頭皮，用血管鉗揭去顱骨和硬腦膜，剪斷雙側(cè)視神經(jīng)后用眼科鑷子迅速取出大鼠的整個(gè)腦組織；冰上剝離全腦，分離下丘腦和前額葉組織，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，放入事先進(jìn)行標(biāo)號(hào)處理的錫紙包裹好，存入液氮中，轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱待測(cè)。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 大鼠一般狀態(tài)觀察 大鼠的精神活動(dòng)狀態(tài)、皮毛顏色是否有光澤、進(jìn)食飲水量、對(duì)外界刺激的反應(yīng)及體質(zhì)量變化等。

2.2.2 血清和下丘腦中CRH、ACTH、CORT 含量測(cè)定 將下丘腦用PBS制成10%的組織漿液，低溫離心15 min，吸取上清液；血清低溫離心15 min，吸取上清液，嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)，采用ELISA 測(cè)定血清和下丘腦組織中CRH、ACTH、CORT 含量。

2.2.3 前額葉5-HT、5HIAA、DA、NE 含量測(cè)定 稱取約0.1 g 大鼠前額葉樣本，加入0.01mol/L HCLO4溶液進(jìn)行前處理，冰浴勻漿，冰水浴超聲30 min。8 000g離心10 min，取上清液，針頭式過(guò)濾器過(guò)濾后，制備成供試品溶液待測(cè)。精確稱取5-HT、5HIAA、DA、NE，分別用水溶解，定容成10 mL 配成標(biāo)準(zhǔn)品溶液后待測(cè)。色譜條件：Kromasil C18 反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相的配制：20 mmol/L 磷酸二氫鉀的水溶液，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，熒光激發(fā)波長(zhǎng)為285 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為318 nm。用流動(dòng)相過(guò)柱子，待基線穩(wěn)定后開(kāi)始加樣。分別精密量取5-HT、5HIAA、DA、NE 標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定，即得。

2.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 軟件分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的以中位數(shù)和四分位數(shù)來(lái)表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠一般狀態(tài) 正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)佳，活動(dòng)靈敏，毛發(fā)光澤干凈，飲食正常，白天慵懶喜臥，夜間興奮好動(dòng)。模型組大鼠晝夜節(jié)律紊亂，精神倦怠，皮膚色澤暗淡，毛發(fā)枯燥，喜靜少動(dòng)，飲食減少，體質(zhì)量降低，時(shí)有焦慮易激惹現(xiàn)象。經(jīng)治療后，GPD 各劑量組和艾司唑侖組大鼠一般狀態(tài)均有不同程度的改善。

3.2 各組大鼠血清和下丘腦中CRH、ACTH、CORT含量比較 血清中上述指標(biāo)以中、低劑量組降低最為顯著，最接近正常對(duì)照組，下丘腦中上述指標(biāo)以中劑量組降低最為顯著，最接近正常對(duì)照組。據(jù)此推測(cè)慢性睡眠剝奪大鼠會(huì)引起HPA 軸功能亢進(jìn)，見(jiàn)表1～表2。

3.3 各組大鼠前額葉5-HT、5-HIAA、NE、DA 含量比較 5-HT 和5-HIAA 升高以中劑量組效果最佳，最接近正常對(duì)照組，NE 和DA 降低分別以高劑量組和中劑量組效果最佳，最接近正常對(duì)照組，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血漿中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量比較（xˉ±s） ng/g

4 討 論

GPD 是臨床治療慢性失眠重要而有效的方劑，王燕等［3］以GPD 加減治療失眠患者32 例，總有效率為93.75%，證實(shí)本方能夠有效改善睡眠質(zhì)量?，F(xiàn)代研究表明：GPD 能明顯延長(zhǎng)戊巴比妥鈉所致小鼠的睡眠時(shí)間，具有鎮(zhèn)靜催眠作用，能提高動(dòng)物腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺、多巴胺等含量，但其治療慢性失眠的作用機(jī)理尚不明確［4］。

本實(shí)驗(yàn)采用改良水平臺(tái)復(fù)制大鼠慢性睡眠剝奪模型，觀察不同劑量GPD 治療慢性失眠可能的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：慢性睡眠剝奪大鼠晝夜節(jié)律紊亂，精神倦怠，皮膚色澤暗淡，毛發(fā)枯燥，喜靜少動(dòng)，飲食減少，體質(zhì)量降低，提示模型制備成功。經(jīng)GPD 治療后，大鼠的一般狀態(tài)明顯改善，提示GPD 具有促眠作用。

CRH、ACTH 和CORT 是HPA 軸重要的組成激素，與睡眠密切相關(guān)。當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)（如慢性睡眠剝奪）的情況下，會(huì)啟動(dòng)激素級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使HPA 軸亢進(jìn)，損傷腦組織［5］。臨床研究表明：在慢性失眠患者中，睡眠時(shí)間少于5 h 的患者，CORT 水平增加，總睡眠時(shí)間與CORT 成反比［6］。最新研究認(rèn)為HPA 軸對(duì)睡眠的影響主要取決于CRH，激活HPA 軸能使ACTH 和CORT 的濃度增加，產(chǎn)生覺(jué)醒效應(yīng)［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組大鼠血清和下丘腦中CRH、ACTH 和CORT 含量均顯著升高，提示大鼠經(jīng)慢性睡眠剝奪后，HPA 軸功能亢進(jìn)。經(jīng)GPD治療后，血清和下丘腦中CRH、ACTH 和CORT 含量顯著降低，可推測(cè)GPD 可通過(guò)降低CRH、ACTH 和CORT 含量，負(fù)反饋調(diào)節(jié)HPA 軸而促睡眠，且以中劑量GPD 效果較優(yōu)。

此外，HPA 軸還受到多種神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控，如5-HT、NE、DA 等。5-HT 能神經(jīng)元可以直接支配下丘腦室旁核分泌CRH，CRH 的釋放又受到5-HT受體的調(diào)控，影響HPA 軸功能；同時(shí)CRH、ACTH 和CORT 又能抑制5-HT 能神經(jīng)元細(xì)胞的活性，二者之間存在復(fù)雜的相互作用［8］。MENON 等［9］使用微透析技術(shù)證明單胺遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物在不同時(shí)長(zhǎng)的睡眠剝奪期間發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HPLC 法檢測(cè)5-HT、5-HIAA、NE 和DA 含量，結(jié)果表明模型組5-HT 和5-HIAA 明顯下降，NE 和DA明顯升高。GPD 治療后能明顯升高5-HT 和5-HIAA 含量，降低NE 和DA 含量，提示GPD 能通過(guò)升高5-HT、5-HIAA 含量，降低NE、DA 含量而治療失眠，且以中劑量GPD 效果最佳。

綜上，GPD 能改善慢性睡眠剝奪大鼠一般狀態(tài)，調(diào)節(jié)5-HT、5-HIAA、NE 和DA 含量，降低CRH、ACTH 和CORT 含量，負(fù)反饋調(diào)節(jié)HPA 軸，改善HPA軸功能亢進(jìn)狀態(tài)，從而治療慢性失眠。然而，本實(shí)驗(yàn)因時(shí)間、技術(shù)有限，未對(duì)慢性睡眠剝奪大鼠的睡眠時(shí)相、腦電波特征進(jìn)行監(jiān)測(cè)，這值得今后深入研究，為GPD 的臨床使用提供科學(xué)依據(jù)。