RNF181、cyclin D1、Ki-67在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義

梁伊靈 付星瑋 李曉波 薄威 張忠 黃波 王旭光 王柏芳 張珉

【摘要】 目的：研究環(huán)指蛋白181（ring finger protein 181，RNF181）、cyclin D1、Ki-67在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織中的表達(dá)水平及其臨床病理學(xué)意義。方法：采用免疫組織化學(xué)染色法檢測83例NSCLC組織及癌旁組織中RNF181、cyclin D1、Ki-67的蛋白表達(dá)情況并分析其臨床病理意義。結(jié)果：在NSCLC組織中RNF181主要定位于細(xì)胞漿，在肺癌組織中普遍低表達(dá);cyclin D1、Ki-67主要定位于細(xì)胞核，在癌組織中相對高表達(dá)。不同腫瘤分化患者NSCLC組織中RNF181表達(dá)、cyclin D1陽性、Ki-67表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;不同局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者NSCLC組織中RNF181表達(dá)、cyclin D1陽性情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同年齡、性別、病理類型患者NSCLC組織中RNF181表達(dá)、cyclin D1陽性、Ki-67表達(dá)情況及不同局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者NSCLC組織中Ki-67表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。NSCLC組織中RNF181表達(dá)與cyclin D1、Ki-67均呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.373、-0.417，P<0.001），cyclin D1與Ki-67表達(dá)水平呈正相關(guān)（rs=0.526，P<0.001）。結(jié)論：RNF181在NSCLC組織中低表達(dá)，cyclin D1、Ki-67在NSCLC組織中高表達(dá)分別與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，并隨腫瘤分化程度或局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況不同而存在差異，三者蛋白表達(dá)水平存在相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】 RNF181 cyclin D1 Ki-67 非小細(xì)胞肺癌 腫瘤進(jìn)展

[Abstract] Objective： To study the expression levels and clinicpathological significance of ring finger protein 181 （RNF181）， cyclinD1 and Ki-67 in non-small cell lung cancer （NSCLC）. Method： Immunohistochemical staining was used to detect the expression of RNF181， cyclin D1 and Ki-67 in 83 cases of NSCLC and adjacent cancer tissues， and their clinicopathological significance was analyzed. Result： In NSCLC tissues， RNF181 was mainly located in the cytoplasm and generally low expression in lung cancer tissues; cyclin D1 and Ki-67?were mainly located in the nucleus and relatively high expression in cancer tissues. There were significant differences in the expression of RNF181， cyclin D1 and Ki-67 in NSCLC tissues of patients with different tumor differentiation （P<0.05）; there were significant differences in the expression of RNF181 and cyclin D1 in NSCLC tissues of patients with different local lymph node metastasis （P<0.05）. There were no significant differences in RNF181 expression， cyclin D1 positive expression and Ki-67 expression in NSCLC tissues of patients with different age， sex and pathological classification and Ki-67 expression in NSCLC tissues of patients with different local lymph node metastasis （P>0.05）. The expression of RNF181 in NSCLC was negatively correlated with cyclin D1 and Ki-67 （rs=-0.373， -0.417， P<0.001）， cyclin D1 was positively correlation with Ki-67 expression （rs=0.526， P<0.001）. Conclusion： The low expression of RNF181 in NSCLC tissues， the high expression of cyclin D1 and Ki-67 in NSCLC tissues are respectively related to tumor progression， they vary with the degree of tumor differentiation and local lymph node metastasis， and the expression levels of these three proteins are correlated.

[Key words] RNF181 cyclin D1 Ki-67 Non-small cell lung cancer Tumor progression

First-author’s address： Basic Medical College of Shenyang Medical College， Shenyang 110034， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.03.009

肺癌是常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)僅在2018年就有約209萬新發(fā)病例，且約有176萬人死于肺癌，占癌癥總死亡人數(shù)的五分之一[1-3]。其中80%都屬于非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），由于篩查方案不足和臨床癥狀出現(xiàn)較晚，大多數(shù)患者診斷時(shí)已為晚期疾病，因此患者預(yù)后通常很差[4-6]。為此，尋找調(diào)控NSCLC進(jìn)展的關(guān)鍵分子，明確其分子機(jī)制，將有利于肺癌的早期診斷及靶向治療，從而降低病死率。

環(huán)指蛋白181（ring finger protein 181，RNF181）基因包含716個(gè)堿基，編碼153個(gè)氨基酸，其在胚胎發(fā)育過程中及胰腺、肝臟、腎臟等25種組織中均有表達(dá)[7-8]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)RNF181在多種腫瘤組織中表達(dá)，但其對腫瘤進(jìn)展的調(diào)控作用尚不十分明確，且存在爭議[9-13]，尤其在NSCLC組織中的表達(dá)情況及臨床病理意義尚無報(bào)道。G1/S-特異性周期蛋白D1（cyclin D1）、增殖標(biāo)志物Ki-67（Marker of Proliferation Ki-67，Ki-67）在NSCLC等多種腫瘤組織中高表達(dá)[14-15]，并與腫瘤進(jìn)展過程密切相關(guān)。本研究旨在通過檢測NSCLC組織中RNF181、cyclin D1及Ki-67的表達(dá)情況，分析這三種蛋白表達(dá)的臨床病理意義及相互關(guān)系，探討它們在腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮的作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年6月-2020年12月遼寧省腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理診斷確診的83例NSCLC標(biāo)本，其中男54例，女29例;年齡39～87歲，平均（60.23±8.36）歲;肺鱗癌29例，肺腺癌54例;出現(xiàn)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。以上所有病例手術(shù)前均未接受任何放射治療及化學(xué)藥物治療。本研究已經(jīng)沈陽醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

1.2.1 主要試劑 PBS磷酸鹽緩沖液（pH值7.2～7.6）、抗原修復(fù)緩沖液（檸檬酸法，pH值6.0）、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、非免疫山羊血清封閉液、即用型免疫組化EliVision plus試劑盒（鼠/兔）、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒等均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，RNF181（F-2）單克隆抗體（鼠抗人）、cyclin D1（A-12）單克隆抗體（鼠抗人）、Ki-67（Ki-67）單克隆抗體（鼠抗人）均購于美國Santacruz公司。

1.2.2 方法 NSCLC組織標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定后，進(jìn)行石蠟包埋，制作成厚度為4 μm的組織切片，所有切片均在統(tǒng)一條件下進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，操作方法如下：（1）切片放入二甲苯及梯度酒精脫蠟水化;（2）加入檸檬酸鈉（pH值6.0）抗原修復(fù)液，通過高壓熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù);（3）經(jīng)PBS洗滌后滴加過氧化物酶阻斷劑，濕盒放入30 ℃孵箱中恒溫孵育20 min;（4）PBS洗滌后，滴加非免疫山羊血清進(jìn)行抗原封閉;（5）滴加一抗：RNF181（1∶650），cyclin D1（1∶150），Ki-67（1∶200），經(jīng)4 ℃過夜孵育，同時(shí)采用PBS代替一抗作為空白對照;（6）滴加EliVision plus試劑盒中反應(yīng)增強(qiáng)液，恒溫30 ℃孵育20 min;（7）PBS洗滌后，滴加酶標(biāo)抗小鼠/兔IgG聚合物，30 ℃恒溫孵育28 min，再次PBS洗滌;（8）二氨基聯(lián)苯胺DAB結(jié)合辣根過氧化物酶顯色;（9）蘇木素復(fù)染細(xì)胞核;（10）脫水、透明、封片、鏡檢。

1.2.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3.1 RNF181 在每張RNF181免疫組織化學(xué)染色切片中，隨機(jī)選取10個(gè)視野（×400），并隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行陽性結(jié)果判定。RNF181定位于細(xì)胞漿，根據(jù)染色強(qiáng)度，無顏色變化為0分，淺黃色為1分，棕色為2分，深棕褐色為3分;根據(jù)染色范圍：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，10%～25%為1分，26%～75%為3分，76%～100%為4分。兩項(xiàng)評分相乘為最終評分（0～12分），<6分為RNF181低表達(dá)，6～12分為RNF181高表達(dá)。

1.2.3.2 cyclin D1 cyclin D1主要定位于細(xì)胞核，陽性表達(dá)為棕色或黃色顆粒，在高倍鏡下進(jìn)行觀察，隨機(jī)選取10個(gè)視野（×400），并隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，按照陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分，核著色陽性率大于5%為cyclin D1陽性，反之記為cyclin D1陰性。

1.2.3.3 Ki-67 Ki-67定位于細(xì)胞核，陽性表達(dá)為棕色或黃色顆粒。在高倍鏡下進(jìn)行觀察，隨機(jī)選取10個(gè)視野（×400），并隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，按照陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分，小于30%記為Ki-67低表達(dá)，30%及以上記為Ki-67高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示;計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNF181、cyclin D1、Ki-67在NSCLC組織中的表達(dá) 83例NSCLC組織中，RNF181主要定位于細(xì)胞漿，見圖1A、1B，其中42例（51%）為低表達(dá)，RNF181在癌旁肺組織中呈中高表達(dá);cyclin D1主要定位于細(xì)胞核，見圖1C、1D。cyclin D1陽性主要出現(xiàn)在NSCLC組織中，癌旁肺組織普遍呈陰性表達(dá);Ki-67主要定位于細(xì)胞核，見圖1E、1F。Ki-67陽性主要出現(xiàn)在NSCLC組織中，癌旁肺組織普遍呈陰性或低表達(dá)。PBS空白對照見圖1G。不同腫瘤分化患者NSCLC組織中RNF181表達(dá)、cyclin D1陽性、Ki-67表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;不同局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者NSCLC組織中RNF181表達(dá)、cyclin D1陽性情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同年齡、性別、病理類型患者NSCLC組織中RNF181表達(dá)、cyclin D1陽性、Ki-67表達(dá)情況及不同局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者NSCLC組織中Ki-67表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1、2、3。

2.2 NSCLC組織中RNF181、cyclin D1、Ki-67蛋白表達(dá)水平相關(guān)性分析 對RNF181、cyclin D1及Ki-67在NSCLC組織中的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)RNF181表達(dá)與cyclin D1及Ki-67表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.373，-0.417，P<0.001），cyclin D1表達(dá)與Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.526，P<0.001）。

3 討論

RNF181（RING finger protein 181）又稱為HSPC238，基因定位于染色體2p11.2[8]，其基因組含有153個(gè)氨基酸編碼716個(gè)堿基[16]，分子質(zhì)量18kDa，屬于環(huán)指蛋白超家族，具有RING型結(jié)構(gòu)域[17]，在多種組織中都有表達(dá)?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，RNF181可能通過整聯(lián)蛋白aⅡbβ3（Integrin aⅡbβ3）或泛素-蛋白酶等途徑發(fā)揮各種復(fù)雜的調(diào)控作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，RNF181蛋白主要定位于細(xì)胞漿中，不同局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化患者NSCLC組織中RNF181表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這提示RNF181可能對NSCLC進(jìn)展發(fā)揮抑制作用。應(yīng)當(dāng)指出，RNF181對腫瘤進(jìn)展的調(diào)控作用尚不十分明確，相關(guān)報(bào)道亦存在矛盾之處。與本研究發(fā)現(xiàn)相似，有研究報(bào)道了RNF181在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、肝癌、胃癌、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中低表達(dá)并與腫瘤進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)[9-10，19-23]。與之相反，部分基于腸癌及三陰性乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)這些腫瘤中RNF181的蛋白表達(dá)水平均高于正常組織，并可通過調(diào)控Hippo信號通路或ERα對腫瘤進(jìn)展發(fā)揮促進(jìn)作用[12-13，24-25]。上述看似矛盾的研究結(jié)果提示：在不同腫瘤組織中，由于RNF181上、下游分子表達(dá)及活化水平不同，可能進(jìn)一步影響到RNF181的表達(dá)及其對腫瘤進(jìn)展的調(diào)控作用，其具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

Ki-67主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，是全面反映細(xì)胞增殖活性的可靠指標(biāo)。其功能與細(xì)胞的有絲分裂及細(xì)胞周期相關(guān)[26-27]。Ki-67在細(xì)胞增殖周期中除G0期外的各期中均有表達(dá)，且在細(xì)胞增殖結(jié)束后會迅速降解，是目前被廣泛應(yīng)用于檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)的標(biāo)記物之一[28-31]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)Ki-67高表達(dá)與包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的分化程度、臨床病理分期、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后等指標(biāo)相關(guān)[14]，提示Ki-67的表達(dá)情況是反映腫瘤進(jìn)展的重要指標(biāo)。本研究亦發(fā)現(xiàn)：不同腫瘤分化患者NSCLC組織中Ki-67表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這與現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)相吻合，提示其可對NSCLC進(jìn)展發(fā)揮促進(jìn)作用。

cyclin D1為細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，為細(xì)胞周期的啟動因子，也是生長感受器[15]。cyclin D1可與CDK4等蛋白結(jié)合，激活CDK激酶活性，促進(jìn)細(xì)胞從G1到S期轉(zhuǎn)換，加速細(xì)胞增殖[32]。此外，cyclin D1還可通過調(diào)控細(xì)胞侵襲能力促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[33-34]。cyclin D1常在肺癌中高表達(dá)，且與腫瘤pTNM分期、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后等臨床病理指標(biāo)相關(guān)[35-39]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，不同腫瘤分化、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者NSCLC組織中cyclin D1陽性情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示其可對NSCLC進(jìn)展發(fā)揮促進(jìn)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC組織中，RNF181表達(dá)與cyclin D1、Ki-67表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（P<0.001），而cyclin D1表達(dá)與Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)（P<0.001）?，F(xiàn)有腫瘤研究對上述三種分子表達(dá)相關(guān)性的報(bào)道不盡相同，與本的研究發(fā)現(xiàn)類似，Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中RNF181、cyclin D1表達(dá)水平負(fù)相關(guān)，RNF181通過ERK/MAPK/cyclin D1/CDK4通路抑制胃癌進(jìn)展。有研究報(bào)道乳腺癌組織中cyclin D1、Ki-67表達(dá)水平呈正相關(guān)[40]，而鱗狀上皮腫瘤中，因P16表達(dá)情況不同，cyclin D1及Ki-67的表達(dá)可分別呈負(fù)相關(guān)或正相關(guān)[41-42]。上訴研究結(jié)果提示：受到多種上、下游分子的影響，RNF181、cyclin D1及Ki-67之間可能存在復(fù)雜的交互作用，并進(jìn)一步調(diào)控腫瘤的進(jìn)展過程。

綜上所述，RNF181在NSCLC組織中相對低表達(dá)，cyclin D1、Ki-67在NSCLC組織中相對高表達(dá)，三者表達(dá)水平存在相關(guān)性，并隨腫瘤分化程度或局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況不同而存在差異，其各自或協(xié)同對腫瘤進(jìn)展的調(diào)控作用及分子機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2021-04-22） （本文編輯：程旭然）