酶底物法測定中山城市供水中的腸球菌

馮飛燕，于曉君，龔 晉，吳佳萍

（中山公用水質(zhì)檢測有限公司，廣東中山 528403）

腸球菌是新國標(biāo)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》 （GB 5749—2022）附錄A 參考指標(biāo)。新國標(biāo)刪除了耐熱大腸菌指標(biāo)，改用埃希氏大腸菌作為糞性污染的指示菌，研究表明腸球菌也是一種優(yōu)于總大腸菌的糞便污染指示物。

在細菌學(xué)分類上，腸球菌（Enterococcus）屬原歸屬于鏈球菌屬。腸球菌易污染食品以及生活和加工用水，易傳播疾病。此外，腸球菌具有天然耐藥和獲得性耐藥的特征，會使所致感染治療困難[1]。因此，腸球菌成為食品、水質(zhì)、加工設(shè)備衛(wèi)生和生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生狀況的評估指標(biāo)。腸球菌的重要特點是在水中存活的時間比大腸桿菌長，對于氯的抵抗力更強。腸球菌可用于輸配水系統(tǒng)維修后或新管線鋪設(shè)后的水質(zhì)檢測[2]。衛(wèi)生學(xué)家認為加強原水中腸球菌的檢測有一定意義，在水廠出廠水及管網(wǎng)水的檢測中增加對腸球菌的監(jiān)測，能進一步保障城市供水安全。

腸球菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法通常有兩種，濾膜法[3]和酶底物法[4]，通過兩種方法對比，季婉菁[5]的結(jié)論是兩種方法均可對飲用水中腸球菌進行檢測，而采用酶底物法更簡便。褚福敏[6]發(fā)現(xiàn)酶底物法能大大降低假陽性和渾濁度、非腸球菌的干擾，更加準(zhǔn)確可靠。山東省地方標(biāo)準(zhǔn)[7]用酶底物法測定飲用水和水源水的腸球菌，遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)[8]用酶底物法測定地表水、地下水、飲用水、海水和工業(yè)廢水中的腸球菌。本文采用酶底物法驗證其正確度和精密度，并應(yīng)用于檢測原水、出廠水、管網(wǎng)水、二次供水，龍頭水，新管道水，老舊小區(qū)管網(wǎng)改造水，對腸球菌在供水全流程中進行風(fēng)險識別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Enterolert腸球菌試劑，97孔定量盤，無菌采樣瓶：100 mL，封口機；恒溫培養(yǎng)箱：（41.0±0.5）℃；紫外燈：6 W，365 nm。

1.2 方法

1.2.1 方法原理

腸球菌利用特異性代謝產(chǎn)物β-葡萄糖苷酶分解培養(yǎng)基中的熒光指示劑4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷，釋放出熒光產(chǎn)物，使樣品在紫外光照射(41.0±0.5)℃，（24±2）h 下產(chǎn)生特征性熒光，以此來檢測樣品中的腸球菌。酶底物法所用試劑包中添加的成分可抑制高達200×104個/100 mL的異樣微生物，能避免非腸球細菌（如沙雷菌屬、克雷伯菌屬和綠色氣球菌屬）干擾而導(dǎo)致的測定結(jié)果誤差，Enterolert 固定底物酶底物營養(yǎng)指示劑檢測腸球菌，提高檢測的準(zhǔn)確度。

1.2.2 樣品采集

檢測水樣來自中山西江流域磨刀門水道、小欖水道、雞鴨水道3 個水道7 個水源地，從北到南分別是磨刀門水道的GZ、QL，NL，小欖水道的DF、DS、D，雞鴨水道的N，還有3 個水庫水，分別是CJ、NT、LT。采樣頻率為每周1 次，連續(xù)3 周。

城市供水選取了城區(qū)主要3 個出廠水，樣品編號為CDF、CQL、CCJ，5 個管網(wǎng)水，樣品編號為G1 ～G5，5 個二次供水，樣品編號為E1 ～E5， 5 個龍頭水，樣品編號為L1 ～L5，4 個新管道水，樣品編號為X1 ～X4，3 個老舊小區(qū)管網(wǎng)改造水，樣品編號為J1 ～J3。

1.2.3 試驗步驟

①將100 mL 水樣倒入無菌采樣瓶中。②將一份EnterolertTM 測試包倒入裝有100 mL 水樣的無菌采樣瓶中。蓋上蓋子，搖勻，至完全溶解。③將瓶中水樣全部倒入97 孔定量盤中，用封口機封口。④將已封口的定量盤放在（41.0±0.5）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) （24±2）h。⑤培養(yǎng)24 h 后，取出定量盒，在暗室中使用6 W，365 nm 的紫外燈在距樣品15 cm 的位置處觀測是否顯示藍色熒光。顯示為藍色熒光的為腸球菌陽性，無熒光的為腸球菌陰性。計數(shù)陽性個數(shù)對照MPN 表得到定量檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的正確度

采用上述方法測定質(zhì)控樣，結(jié)果如表1。從陰陽性控制看，酶底物EnterolertTM 對大腸桿菌（陰性對照）與腸球菌（陽性標(biāo)樣）反應(yīng)合格。糞腸球菌質(zhì) 控 真 值 為（1 813±332）MPN/100 mL，log 值 為（3.26±0.70），可 接 受 范 圍 為881 ～4 097 MPN/ 100 mL，兩次質(zhì)控結(jié)果在可接受范圍內(nèi)。兩次質(zhì)控平均值為950.1 MPN/100 mL，log 值為2.98，相對誤差為8.6%，平行雙樣的重復(fù)性r=0.03，滿足食品微生物實驗室內(nèi)平行雙樣重復(fù)性的要求r≤0.25[9]。

表1 酶底物法測定質(zhì)控樣結(jié)果

2.2 方法的精密度

根據(jù)食品微生物實驗室7 和ISO 4833-1：2013[10]質(zhì)控規(guī)定，使用相同方法，在同一實驗室檢測同一種物質(zhì)，由同一操作者使用同一設(shè)備在短時間內(nèi)的兩次獨立的單次試驗結(jié)果的絕對差值，不應(yīng)大于重復(fù)性限r(nóng)=0.25，以10 為底的每毫升中微生物計數(shù)的對數(shù)。表2 用實際水樣驗證方法的精密度，從重復(fù)性r判斷方法精密度（r=log10平行1－log10平行2），計數(shù)＞10 MPN/100 mL 的樣品平行雙樣r可達到質(zhì)控要求，計數(shù)＜10 MPN/100 mL 的樣品難以達到質(zhì)控要求。

2.3 地表水腸球菌的測定結(jié)果

選取中山市部分地表水，包括西江3 條水道7個供水水源地，3 個水庫水，利用酶底物法測定以上10 個地表水腸球菌，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，西江源水腸球菌遠比水庫水高，中山用于供水水源的水庫遷移了村民，禁止工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，因此受到糞便污染少；DS 源水腸球菌比其他水源地高很多，此水源地在中山供水規(guī)劃中將被取締。

表2 實際水樣測定腸球菌的精密度

糞（耐熱）大腸菌群（Thermotolerant coliforms）和腸球菌（Enterococcus）都是判斷污染來源的糞便污染指示物。表3 對比了中山市以上10 個地表水糞大腸菌群和腸球菌，當(dāng)樣品檢測出糞大腸菌為陽性時，腸球菌也為陽性，定量結(jié)果腸球菌比糞大腸菌群小，這跟褚福敏[6]報道一致。糞大腸菌群是《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 3838—2002）唯一糞便污染指示菌。日益進步的微生物學(xué)、流行病學(xué)及統(tǒng)計學(xué)方法進一步證實，腸球菌是優(yōu)于總大腸菌群和糞大腸菌群的糞便污染指示物[5]。我國2022 年3 月新發(fā)布的《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 5749—2022）采用更有衛(wèi)生意義的指示菌——埃希氏大腸菌，刪除了耐熱大腸菌群，在附錄A 的參考指標(biāo)中仍然保留腸球菌。

表3 中山市部分地表水糞性大腸菌和腸球菌對比

2.4 城市供水腸球菌的測定

城市供水選取了城區(qū)主要3 個出廠水CDF、CQL、CCJ，5 個管網(wǎng)水G1 ～G5，5 個二供泵 房E1 ～E5，5 個 龍 頭 水L1 ～L5，4 個 新 管 道 水X1 ～X4，3 個老舊小區(qū)管網(wǎng)改造水J1 ～J3。測定以上25 個水樣的余氯、總大腸菌群、腸球菌，結(jié)果見表4。當(dāng)飲用水中有余氯存在下或經(jīng)過余氯消毒，全流程節(jié)點總大腸菌和腸球菌都未檢出。

表4 城市供水全流程測定余氯、總大腸菌群、腸球菌

3 結(jié)論

本文驗證酶底物法測定水中腸球菌方法，對中山市有代表性的10 個水源地，25 個城市供水用酶底物法測定腸球菌，結(jié)論如下。

（1）酶底物法測定水中腸球菌質(zhì)控平均值 950.1 MPN/100 mL，在可接受范圍881 ～4 907 MPN/ 100 mL。實際水樣測定腸球菌驗證方法精密度，得到測定值＞10 MPN/100 mL 的水樣，實驗室內(nèi)重復(fù)性r≤0.25，滿足微生物質(zhì)控要求。因此，酶底物法測定水中腸球菌方法準(zhǔn)確、可靠。

（2）用酶底物法測定中山市地表水的10 個水源地樣品中的腸球菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)西江水比水庫腸球菌高。腸球菌與糞大腸菌定性一致，定量更小。

（3）用酶底物法測定中山城市供水全流程出廠水、管網(wǎng)水、二次供水、龍頭水、新管道水和老舊小區(qū)管網(wǎng)改造水的腸球菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在有余氯存在下或經(jīng)過余氯消毒，城市供水均未檢出，因此正常供水狀態(tài)下，腸球菌的風(fēng)險主要在于源頭，城市供水其他環(huán)節(jié)的腸球菌風(fēng)險低。