同位素內(nèi)標(biāo)-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定肉類中17 種全氟化合物

林永濤，謝燕湘，曾小元，李兆敏，黃開(kāi)慧

（常德市疾病預(yù)防控制中心，湖南常德 415000）

全氟化合物（Perfluorinated Compounds，PFCs）是一大類有機(jī)化合物中與碳原子相連的氫原子被氟原子完全替代的有機(jī)物的統(tǒng)稱，主要包括全氟烷基類、全氟羧酸、全氟磺酸、全氟磷酸等，因其結(jié)構(gòu)中含有高鍵能的碳氟鍵，而化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能夠受強(qiáng)的紫外光照、加熱、化學(xué)和微生物作用，在自然環(huán)境中能長(zhǎng)期存在難以降解[1-2]。PFCs 廣泛應(yīng)用于阻燃劑、表面活性劑、催化劑、殺蟲(chóng)劑和紡織品等諸多領(lǐng)域[3-4]。PFCs 具有神經(jīng)毒性、免疫毒性、遺傳毒性、甲狀腺毒性等，研究表明，PFCs 通過(guò)各種途徑進(jìn)入自然環(huán)境中，并能通過(guò)食物鏈累積[5-8]。肉類是人類必不可少的食物來(lái)源，食品中主要肉類來(lái)源的相關(guān)動(dòng)物在食物鏈中處于中后端，使處于食物鏈頂端的人類食用相關(guān)肉類后存在的健康風(fēng)險(xiǎn)加大。目前肉類中PFCs 測(cè)定相關(guān)國(guó)標(biāo)是《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物源性食品中全氟辛烷磺酸（PFOS）和全氟辛酸（PFOA）的測(cè)定》（GB 5009.253—2016），只測(cè)定其中兩種PFCs，沒(méi)有多種PFCs 的檢測(cè)方法，不能全面反映肉類中PFCs 污染情況，建立相關(guān)分析方法了解肉類食品中PFCs 的含量對(duì)食品安全標(biāo)準(zhǔn)的制定有一定參考意義[9-12]。同位素內(nèi)標(biāo)法是在樣品前處理過(guò)程中加入待測(cè)化合物的同位素內(nèi)標(biāo)物，利用待測(cè)物與對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)的比值來(lái)測(cè)定待測(cè)濃度的方法，彌補(bǔ)了外標(biāo)法的一些不足，增強(qiáng)了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[13-16]。本實(shí)驗(yàn)用同位素內(nèi)標(biāo)法，采用乙腈/水超聲萃取肉類中17 種PFCs，經(jīng)固相萃取柱凈化分離，由UPLC-MS/MS 分析檢測(cè)，定量準(zhǔn)確、靈敏度高，用于實(shí)際肉類樣品中PFCs的分析測(cè)定，獲得了滿意的結(jié)果，為肉類質(zhì)量安全檢測(cè)及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配Turbo V 電噴霧離子源（QTRAP 4500，美國(guó)AB SCIEX 公司）；Analyst 1.7.2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)AB SCIEX 公司）；ExionLC 超高效液相（日本島津公司）；色譜柱：Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，飛 諾 美 公司）；Milli-Q Ultrapuer Water 超純水自動(dòng)制水系統(tǒng)（美國(guó)密理博公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ-250DE 型數(shù)控超聲萃取器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；NP-30S 渦旋樣品混勻器（常州市恩培儀器制造公司）；QSJ-C04B1 小熊樣品粉碎機(jī)（佛山小熊電器股份有限公司）；1.0 mL 和 5.0 mL Eppendorf 手動(dòng)移液槍（德國(guó)Eppendorf 股份公司）；湘儀TGL-20M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；針式過(guò)濾器：0.22 μm孔徑尼龍濾膜（津騰公司）；氣源：氮?dú)獍l(fā)生器（Peak公司）；固相萃取柱：Captiva EMR-Lipid，3 mL，300 mg（Agilent 公司）。

17 種全氟化合物混合標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司，濃度為100 μg·mL-1，溶劑為乙腈；9 種全氟化合物的18O 取代或13C 取代同位素混合內(nèi)標(biāo)溶液：美國(guó)Wellingtons Lab 產(chǎn)品，9 種同位素混合內(nèi)標(biāo)溶液的濃度是2 000 ng·mL-1，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液溶劑是甲醇。實(shí)驗(yàn)用17 種全氟化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液里面包含13 種全氟取代烷基羧酸和4 種全氟取代烷基磺酸鹽，它們分別是全氟丁烷羧酸（PFBA）、全氟戊烷羧酸（PFPeA）、全氟己烷羧酸（PFHxA）、全氟庚烷羧酸（PFHpA）、全氟辛烷羧酸（PFOA）、全氟壬烷羧酸（PFNA）、全氟癸烷羧酸（PFDA）、全氟十一烷羧酸（PFUdA）、全氟十二烷羧酸（PFDoA）、全氟十三烷羧酸（PFTrDA）、全氟十四烷羧酸（PFTeDA）、全氟十六烷羧酸（PFHxDA）、全氟十八烷羧酸（PFODA）、全氟丁烷磺酸鉀（PFBS）、全氟己烷磺酸鈉（PFHxS）、全氟辛烷磺酸鉀（PFOS）和全氟癸烷磺酸鈉（PFDS）。9 種全氟化合物內(nèi)標(biāo)溶液中含有7 種全氟烷基羧酸13C 取代內(nèi)標(biāo)和2 種全氟烷基磺酸鹽18O 取代內(nèi)標(biāo)，它們分別是全氟丁烷羧酸內(nèi)標(biāo)（13C4-PFBA）、全氟己烷羧酸內(nèi)標(biāo)（13C2-PFHxA）、全氟辛烷羧酸內(nèi)標(biāo)（13C4-PFOA）、全氟壬烷羧酸內(nèi)標(biāo)（13C5-PFNA）、全氟癸烷羧酸內(nèi)標(biāo)（13C2-PFDA）、全氟十一烷羧酸內(nèi)標(biāo)（13C2-PFUdA）、全氟十二烷羧酸內(nèi)標(biāo)（13C4-PFDoA）、全氟己烷磺酸鈉內(nèi)標(biāo)（18O2-PFHxS）和全氟辛烷磺酸鉀（13C4-PFOS）。

甲醇（質(zhì)譜級(jí)，德國(guó)Merk 公司）；甲酸（質(zhì)譜級(jí)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲酸銨（質(zhì)譜級(jí)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙腈（質(zhì)譜級(jí)，德國(guó)Merk 公司）。

1.2 儀器條件

（1）色譜條件。流動(dòng)相A：濃度為2 mmol·L-1甲酸銨水溶液；流動(dòng)相B：純甲醇；流 速： 0.30 mL·min-1；色譜柱溫：40 ℃；樣品進(jìn)樣體積：10 μL；梯度洗脫程序：0 ～2 min 時(shí)，流動(dòng)相A、B分別為60%和40%，2 ～7 min 時(shí)流動(dòng)相A、B 分別為5%和95%，7 ～10 min 流動(dòng)相A、B 分別為60%和40%。

（2）質(zhì)譜條件。Turbo V 電噴霧離子源（ESI）；串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)模式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）；質(zhì)譜離子化電壓：-4 500 V；離子源溫度：555 ℃；氣簾氣的氣體壓力：37 psi；碰撞氣流速：中等；霧化氣氣體壓力：51 psi；輔助氣氣體壓力：51 psi；駐留時(shí)間：16 ms。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

用甲醇將17 種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和9 種同位素混合內(nèi)標(biāo)溶液分別配制成濃度為200 ng·mL-1使用液， 4 ℃保存。用甲醇/水溶液（40/60）將17 種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋為濃度0.2 ng·mL-1、0.4 ng·mL-1、 0.8 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、1.5 ng·mL-1和2.0 ng·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)組成的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)中全氟化合物的定量?jī)?nèi)標(biāo)物濃度均為1.0 ng·mL-1。

1.4 樣品采集與處理

肉類樣品采自市區(qū)各大菜市場(chǎng)和超市。準(zhǔn)確稱取樣品2 g（精確至0.00 01 g）置于15 mL 聚丙烯具塞離心管中，加入100 μL 全氟化合物同位素內(nèi)標(biāo)稀釋使用液（200 ng·mL-1），準(zhǔn)確加入2.0 mL 超純水，渦旋振蕩3 min，加入色譜純8.0 mL 乙腈，超聲萃取30 min，10 000 r·min-1常溫離心10 min，取上清液3.0 mL 過(guò)固相萃取柱，棄去約1 mL 流出液，過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜，取過(guò)濾液0.5 mL加超純水0.5 mL 混勻，供UPLC-MS/MS 測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

不同的流動(dòng)相組成對(duì)樣品的分離起重要作用，考察了以0.1%甲酸水/甲醇、0.1%甲酸水/乙腈、2 mmol·L-1甲 酸 銨 水/ 甲 醇 和2 mmol·L-1甲 酸 銨水/乙腈為流動(dòng)相時(shí)，17 種全氟化合物在等度洗脫和梯度洗脫條件下的響應(yīng)及分離效果。結(jié)果表明，以2 mmol·L-1甲酸銨水/甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)17 種全氟化合物可以較好地分離。色譜柱同樣影響樣品的分離，比較了Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）和ACQUITY UPLC BEH Shield RP18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）兩種類型的色譜柱對(duì)17種全氟化合物的分離情況，結(jié)果顯示兩種色譜柱都能實(shí)現(xiàn)較好的分離，Kinetex C18柱分離效果更佳，峰形更對(duì)稱，且能夠在10 min 內(nèi)分離17 種全氟化合物，ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 柱需要15 min 以上，為提高分析效率，采用Kinetex C18柱進(jìn)行分析。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

配制濃度為100 μg·L-1的17 種全氟化合物和9種內(nèi)標(biāo)物的使用液，選擇ESI（-）電離模式，用針泵進(jìn)樣，在質(zhì)譜模式下，對(duì)各化合物進(jìn)行全掃描，獲得每種氟化物的母離子信息，再經(jīng)質(zhì)譜子離子掃描，得到每種氟化物的子離子信息，根據(jù)每種離子豐度比選擇相應(yīng)的定量、定性離子對(duì)，并對(duì)每種氟化物的去簇電壓和碰撞能量參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，從而得到最優(yōu)MRM 模式下質(zhì)譜的檢測(cè)條件。17 種全氟化合物和9 種內(nèi)標(biāo)物的MRM 質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表1。在優(yōu)化好的條件下進(jìn)行測(cè)定，1.0 ng·mL-117 種全氟化合物和9 種內(nèi)標(biāo)物的總離子流圖如圖1 所示。

表1 17 種全氟化合物和9 種內(nèi)標(biāo)物的MRM 模式質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)

圖1 17 種全氟化合物和9 種內(nèi)標(biāo)物的總離子流圖（1.0 ng·mL-1）

2.3 線性范圍、檢出限、定量限、精密度和回收率

按照優(yōu)化的儀器條件，由低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液到高濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)行測(cè)定。以待測(cè)物和與之對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的濃度比值作為橫坐標(biāo)，以待測(cè)物的峰面積和與之對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，17 種全氟化合物在0.2 ～2.0 ng·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均≥0.993。采用空白基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)以3 倍信噪比（S/N=3）估算待測(cè)物的檢出限，以10 倍信噪比（S/N=10）估算待測(cè)物的定量限，以2 g 樣品經(jīng)處理后定容至1 mL 計(jì)，17 種全氟化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、定量限及檢出限見(jiàn)表2。分別準(zhǔn)確稱取2 g（精確至0.000 1 g）未檢出全氟化合物的肉類樣品豬肉和魚(yú)肉各一份添加 100 μL 濃度為200 ng·mL-1的17 種全氟化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，與實(shí)際樣品一樣前處理后進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6 次，其回收率及其相對(duì)偏差（RSD）見(jiàn)表2。

表2 17 種全氟化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率及相對(duì)偏差

（續(xù)表1）

（續(xù)表2）

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用優(yōu)化的檢測(cè)條件，對(duì)市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)28 份肉類樣品，包括14 份豬肉和14 份不同種類魚(yú)肉進(jìn)行17 種全氟化合物測(cè)定，結(jié)果顯示，所有豬肉樣品中均未檢出，3 份魚(yú)肉樣品檢出PFOS，分別為多寶魚(yú) 2.1 μg·kg-1、桂魚(yú)29.7 μg·kg-1、鱸魚(yú)1.2 μg·kg-1。

3 結(jié)論

本文用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，通過(guò)條件優(yōu)化，建立了一種基于負(fù)離子掃描的同位素內(nèi)標(biāo)-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定肉類中17 種全氟化合物的分析方法。方法操作簡(jiǎn)便快速、實(shí)用性強(qiáng)，可大批量同時(shí)快速檢測(cè)肉類中17 種全氟化合物，對(duì)實(shí)際樣品分析結(jié)果表明，水產(chǎn)品存在一定的全氟化合物污染。