高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水果、蔬菜中雙胍辛胺的定性定量分析研究

尹麗麗

（上海華測(cè)品標(biāo)檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 201112）

雙胍辛胺是一種廣譜性殺真菌劑，對(duì)某些病原真菌有很高的生長(zhǎng)抑制活性，其作用方式是抑制病菌類脂的生物合成，是觸殺和預(yù)防性殺菌劑，對(duì)大多數(shù)由子囊菌和半知菌引起的真菌病害有很好的效果[1]。雙胍辛胺主要在果樹休眠期施用，可防治蘋果樹腐爛病、花腐病、葡萄黑痘病、蘆筍莖枯病以及麥類雪腐病、腥黑穗病和柑橘貯藏病害，特別對(duì)柑橘青霉病、綠霉病和酸腐效果更好，對(duì)防治小麥雪腐病也非常有效。此外，其膏劑還被推薦作為野兔、鼠類和鳥類的驅(qū)避劑，同目前市場(chǎng)上的殺菌劑無交互抗性。其危害性主要有3 個(gè)方面。①健康危害：本品為中等毒性殺蟲劑，對(duì)眼睛和皮膚有刺激作用。②環(huán)境危害：對(duì)環(huán)境可能有危害，對(duì)水體可造成污染。③燃爆危險(xiǎn)：本品可燃，有毒，具有刺激性[2]。目前，檢測(cè)水果、蔬菜中雙胍辛胺的方法主要有比色法、氣相色譜法、液相色譜法[3-4]。本文用正丁醇∶正己烷=1 ∶1 混合溶液提取，再用酸化水凈化，建立水果、蔬菜中雙胍辛胺的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）分析方法[5-11]。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

鹽酸胍（分析純），三乙胺（分析純），氫氧化鈉（分析純），正丁醇（色譜級(jí)），正己烷（色譜級(jí)），氯化鈉（分析純），硫酸（分析純），標(biāo)準(zhǔn)品：雙胍辛胺三乙酸鹽（CAS：57520-7-9），純度＞98%；聚四氟乙烯膜（0.22 μm），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：島津8050，島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；電子天平：感量0.000 1 g 和0.01 g，瑞士梅特勒；高速組織搗碎機(jī)：德國IKA；離心機(jī)：轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1，美國ThermoFisher；超純水儀：美國Millipore 公司；超聲提取器、渦旋振蕩器：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取適量雙胍辛胺三乙酸鹽于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，混勻，配制成濃度為 1.0 mg·mL-1的儲(chǔ)備溶液，吸取0.1 mL 儲(chǔ)備溶液至10 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，混勻，配制成濃度為10 μg·mL-1的中間液，吸取適量中間液至空白樣品基質(zhì)中，按樣品前處理流程操作，制備成濃度水平為10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1和500 ng·mL-1的 標(biāo) 準(zhǔn) 品工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理

稱取2 g 試樣（精確至0.01 g）于50 mL 刻度離心管中，加0.5 g鹽酸胍，2 mL三乙胺溶液，0.5 g氯化鈉，15 mL 正丁醇∶正己烷=1 ∶1，渦旋振蕩提取 10 min，10 000 r·min-1離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有1 mL 三乙胺的分液漏斗中，重復(fù)提取一次，合并上清液至分液漏斗中，加入4.7 mL 水和0.3 mL的1 mol·L-1硫酸，搖動(dòng)提取5 min，靜置10 min，取水相溶液過0.22 μm 的聚四氟乙烯膜，供HPLCMS/MS 進(jìn)樣分析測(cè)定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY BEH HILIC 色譜柱（1.7 μm，2.1 mm ×100 mm）；流動(dòng)相A：250 mmol·L-1乙酸銨溶液，流動(dòng)相B：甲醇；流速：0.35 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL，流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜條件-流動(dòng)相梯度

1.3.4 質(zhì)譜條件

電離方式：ESI+；監(jiān)測(cè)模式：質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；離子源溫度：400 ℃；毛細(xì)管電壓：4 kV，氣流量：780 L·h-1；檢測(cè)方式：MS/MS。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)雙胍辛胺的分子量及化學(xué)性質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化，其中離子源參數(shù)詳見1.3.4。對(duì)雙胍辛胺進(jìn)行離子對(duì)優(yōu)化，選擇兩對(duì)響應(yīng)大、離子豐度大且干擾小的離子對(duì)分別作為定量和定性離子，此兩對(duì)離子對(duì)再選擇響應(yīng)較大、豐度較大的離子對(duì)作為定量離子，采用MRM 方式進(jìn)行分析，母離子、子離子對(duì)和碰撞能量見表2。

表2 母離子、子離子對(duì)和碰撞能量

在質(zhì)譜條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對(duì)液相條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了1.3.3 的液相條件，在此條件下，目標(biāo)物能夠在合適的時(shí)間被檢測(cè)出，并能與干擾物很好地分離。

2.2 方法的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、檢出限和定量限

采用空白樣品基質(zhì)提取液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)過多點(diǎn)驗(yàn)證，最終確定曲線范圍為10 ～500 ng·mL-1，在此范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999 7，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。以3 倍信噪比為檢出限，10 倍信噪比為定量限，雙胍辛胺的檢出限為0.002 0 mg·kg-1，定量限為0.011 mg·kg-1。

2.3 回收率和精密度

采用空白樣品驗(yàn)證方法的回收率和精密度，具 體 操 作 為 在 空 白 樣 中 分 別 添 加50 μg·kg-1、 100 μg·kg-1、500 μg·kg-13 個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)品，采用本文確定的前處理及儀器條件，每個(gè)濃度值進(jìn)行6 平行的重復(fù)測(cè)試，外標(biāo)法校正，得出本實(shí)驗(yàn)方法的回收率如表3 所示。水果回收率在1.15%～4.45%；蔬菜回收率在96.2% ～110.0%；水果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.16% ～4.43%，蔬菜相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.36%～2.15%，表明回收率和精密度都能滿足檢測(cè)需求。

表3 水果、蔬菜中雙胍辛胺的回收率和精密度

3 結(jié)論

本文研究并建立了雙胍辛胺的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，通過實(shí)際基質(zhì)樣品驗(yàn)證，用基質(zhì)加標(biāo)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，能得到良好的線性范圍，回收率和精密度符合檢測(cè)要求，檢出限和定量限也均能滿足測(cè)試需求。整個(gè)方法前處理相對(duì)簡(jiǎn)單、快速、高效，能滿足水果、蔬菜中雙胍辛胺的檢測(cè)要求，此方法為雙胍辛胺的檢測(cè)提供了新的檢測(cè) 手段。