液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中氯霉素殘留量

謝冬霞

（深圳三方圓檢測監(jiān)管服務(wù)有限公司，廣東深圳 518110）

氯霉素作為一種廣譜抗生素，對革蘭氏菌（陰性菌和陽性菌）有很好的抑制作用，因其具有穩(wěn)定的藥性、良好的抗菌性和價格低廉，曾在一段時間內(nèi)作為細(xì)菌性疾病的治療藥物，在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用。但人們在使用中發(fā)現(xiàn)氯霉素具有毒性，且CAP 會在動物性食品中殘留，通過動物性食品對人的健康產(chǎn)生毒害作用[1]。研究表明，氯霉素存在嚴(yán)重的副作用，可引起人體的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏等疾病，因此殘留在動物源性食品中的氯霉素對人類的健康構(gòu)成了潛在的危害[2]。世界上很多國家禁止食源性動物使用氯霉素，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的第250 號公告也禁止其在食品動物中使用。目前，氯霉素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法、金標(biāo)試紙條法、高效液相色譜法、氣相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[3-5]，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以其選擇性高、靈敏度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)勢，成為畜禽產(chǎn)品中氯霉素的常用檢測方法。本研究參照 GB 31658.2—2021[6]，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件和檢測需求，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中氯霉殘留量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉（購于某農(nóng)貿(mào)市場）。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品（編號BW300320200， 純度99.80%， 品 牌LGC）；氯霉素-D5（ 編 號BW901405-100-H，濃度為100 μg·mL-1，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；甲醇（色譜純，賽默飛）；乙腈（色譜純，賽默飛）；正己烷、乙酸乙酯、氯化鈉（分析純，西隴科學(xué)）；C18固相萃取柱（500 mg/3 mL，購于逗點(diǎn)生物）；實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T 6682—2008二級。

1.2 儀器與設(shè)備

U1timate3000+TSQ Fortis 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國賽默飛公司）；HZ-104/35S 分析天平（福州華志科學(xué)儀器）；JP-240ST 超聲（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；DC-24氮吹儀（上海安譜科學(xué)儀器）；DDL5 大容量冷凍離心機(jī)（長沙英泰儀器有限公司）；WH-3 渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；明澈-TD 24UV 超純水系統(tǒng)（Millipore）。

1.3 試樣處理過程

稱取5.00 g 試樣于50 mL 離心管中，加入 250 μL 內(nèi)標(biāo)工作液、5 mL 乙腈、5 mL 4%氯化鈉溶液，振蕩渦旋2 min，于4 000 r·min-1離心機(jī)中離心8 min，取上清液，重復(fù)提取1 次，上清液合并。加5 mL 正己烷，振蕩渦旋1 min，于2 000 r·min-1離心8 min，丟棄上層液，重復(fù)處理1 次。加5 mL（水飽和的）乙酸乙酯，振蕩渦旋1 min，2 000 r·min-1離心8 min。上層液轉(zhuǎn)移至新的15 mL 離心管，水飽和的乙酸乙酯重復(fù)提取1 次，提取液合并，用氮?dú)獯蹈?，加? mL 水-乙腈（95 ∶5，v/v）溶解，備用。

取C18固相萃取柱，依次用10 mL 甲醇、10 mL 水預(yù)洗。取備用液過柱，加3 mL 水洗柱，重復(fù)1 次，加4 mL 甲醇-水（50 ∶50，v/v），以1 mL·min-1的速度進(jìn)行洗脫，用15 mL 離心管收集洗脫液。加4 mL 水飽和乙酸乙酯，振蕩渦旋1 min，于2 000 r·min-1離心機(jī)離心5 min，取上層液，加4 mL 水飽和乙酸乙酯重復(fù)處理1 次，上層溶液合并，氮?dú)獯蹈?。? mL 甲醇-水（50 ∶50，v/v）溶解，取上清液過0.22 μm 濾膜后上機(jī)分析。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取10 mg 氯霉素，用甲醇稀釋、定容至100 mL 容量瓶中，搖勻，配制成100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取適量氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇-水（50 ∶50）分別稀釋成濃度為100 ng·mL-1、50 ng·mL-1和10 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

氯霉素內(nèi)標(biāo)工作液：準(zhǔn)確量取適量氯霉素-D5原液，用甲醇-水（50 ∶50）稀釋成濃度為20 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：用流動相配制成濃度為 0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1，內(nèi)標(biāo)濃度為5 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，詳見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制表（單位：μL）

1.5 儀器分析條件

1.5.1 液相色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD Silica（2.1 mm×100.0 mm，1.9 μm）；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：2 μL。流動相：甲醇（A）+水（B），梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序表

1.5.2 質(zhì)譜工作條件

離子源：H-ESI；離子模式：負(fù)離子；掃描模式：多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源溫度：350 ℃；鞘氣：35 arb；離子轉(zhuǎn)移管溫度：300 ℃；輔助氣：8 arb；尾氣：0 arb；監(jiān)測離子參數(shù)情況見表3。

表3 氯霉素特征離子質(zhì)譜條件表

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性關(guān)系

將配制的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在1.5 儀器條件下上機(jī)測試，以特征離子質(zhì)量色譜峰外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度點(diǎn)作為橫坐標(biāo)，采用色譜工作站自動擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性回歸方程為y=0.199 8x+0.483 9，相關(guān)系數(shù)為0.999。結(jié)果表明，氯霉素在0.5 ～20.0 ng·mL-1線性關(guān)系良好，見圖1 相關(guān)系數(shù)R大于0.995，滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對線性關(guān)系的規(guī)定。

圖1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖

2.2 檢出限與定量限

稱取5.00 g 陰性豬肉，加入0.01 mL 濃度為 0.5 μg·kg-1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（即加入量為0.1 μg·kg-1），按照1.3 試樣處理過程、1.5 儀器條件分析測定，測得氯霉素的信噪比S/N為683.98，大于3.0，本方法中氯霉素的檢出限為0.1 μg·kg-1；稱取5.00 g 陰性豬肉，加入0.02 mL 濃度為0.5 μg·kg-1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（即加入量為0.2 μg·kg-1），按照1.3 試樣處理過程、1.5 儀器條件分析測定，測得氯霉素的信噪比S/N為3 453.11，大于10.0，本方法中氯霉素的定量限為 0.2 μg·kg-1，檢出限與定量限均滿足標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)要求。

2.3 加標(biāo)回收率及精密度

稱取陰性豬肉樣品，分別添加低（0.20 μg·kg-1）、中（1.00 μg·kg-1）、高（2.00 μg·kg-1）3 個濃度水平的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3 試樣處理過程、1.5 儀器分析條件將各濃度水平平行測定6 次，考察方法的加標(biāo)回收情況與精密度（以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 表示），試驗(yàn)結(jié)果見表4。氯霉素在0.20 ～2.00 μg·kg-1添加水平下，回收率在72.2%～109.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 在1.7%～7.1%，回收率與精密度均符合方法標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

表4 加標(biāo)回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究參照GB 31658.2—2021 建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中氯霉素殘留量的分析方法，該方法前處理過程簡便、分離效果好、分析速度快，可進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量分析，經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，該方法線性關(guān)系良好，檢出限與定量限、加標(biāo)回收情況及方法精密度都滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，可滿足食品檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)對豬肉中氯霉素殘留的批量快速檢測需求。