水產(chǎn)品中苯并[α]芘來(lái)源及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

夏 虹 劉 麗 彭西甜 彭立軍 林 春

(1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064；2. 農(nóng)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064；3. 長(zhǎng)江大學(xué)，湖北 荊州 434023)

水產(chǎn)品是海洋和淡水漁業(yè)生產(chǎn)的水產(chǎn)動(dòng)植物產(chǎn)品及其加工產(chǎn)品的總稱(chēng)。水產(chǎn)品的生長(zhǎng)過(guò)程與環(huán)境息息相關(guān)。然而一些水產(chǎn)品養(yǎng)殖環(huán)境(如水質(zhì)、土壤等)遭受了不同程度的污染，嚴(yán)重影響了水產(chǎn)品質(zhì)量。加之水產(chǎn)品養(yǎng)殖過(guò)程中不規(guī)范使用魚(yú)用藥物、飼料及加工過(guò)程中添加劑的過(guò)量使用，尤其是違禁藥物的違規(guī)使用，導(dǎo)致水產(chǎn)品中有毒有害殘留物質(zhì)超標(biāo)現(xiàn)象嚴(yán)重[1]。在眾多污染物中，苯并[α]芘暴露對(duì)水生生物的非特異性免疫能力和組織結(jié)構(gòu)均會(huì)產(chǎn)生一定程度的負(fù)面影響，嚴(yán)重威脅水生生物的生存、進(jìn)化及繁衍，進(jìn)而威脅人類(lèi)生命健康[2]。研究主要對(duì)水產(chǎn)品中苯并[α]芘的來(lái)源、苯并[α]芘性質(zhì)及其暴露對(duì)水產(chǎn)品的危害進(jìn)行總結(jié)，分析各種苯并[α]芘檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)和不足之處，對(duì)水產(chǎn)品中苯并[α]芘未來(lái)檢測(cè)方法的研究方向進(jìn)行展望，為水產(chǎn)品質(zhì)量安全和水產(chǎn)品中苯并[α]芘檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 水產(chǎn)品中苯并[α]芘來(lái)源

水產(chǎn)品中苯并[α]芘污染來(lái)源主要包括水體污染和食品加工等。

苯并[α]芘通過(guò)吸附作用沉積在大氣中的顆粒上，而這些顆粒又通過(guò)沉降、降水、沖洗等作用進(jìn)入地面水，造成水體污染。據(jù)研究[3]報(bào)道，長(zhǎng)三角和珠三角地區(qū)水體苯并[α]芘的污染程度顯著高于其他地區(qū)，太湖中的苯并[α]芘污染程度稍重于長(zhǎng)江和遼河，海洋中的苯并[α]芘含量明顯高于淡水湖。苯并[α]芘的難降解性導(dǎo)致水體中苯并[α]芘的積累不斷增多，生物積累作用使得苯并[α]芘的積蓄隨水體中水生生物的生長(zhǎng)發(fā)育不斷加強(qiáng)，隨后通過(guò)生物性遷移、生物放大作用逐漸擴(kuò)大污染范圍，最終危害整個(gè)水生生態(tài)系統(tǒng)和人類(lèi)健康[4]。

煙熏和燒烤是水產(chǎn)品常見(jiàn)的加工方式，是將經(jīng)腌制或熟制后的水產(chǎn)品以煙熏或明火為介質(zhì)進(jìn)行熱加工。熏烤過(guò)程中，苯并[α]芘有可能伴著燃料木炭燃燒產(chǎn)生的煙霧進(jìn)入到水產(chǎn)品中；與此同時(shí)，水產(chǎn)品自身的脂肪、糖等化學(xué)物質(zhì)不完全燃燒、高溫裂解，經(jīng)熱聚合反應(yīng)也會(huì)形成苯并[α]芘。研究[5]表明，隨著銷(xiāo)售時(shí)間和貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，苯并[α]芘會(huì)由食物表層向內(nèi)部滲透，時(shí)間越長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移滲透量越大。在煙熏和燒烤過(guò)程中發(fā)生焦烤或炭化時(shí)，苯并[α]芘生成量顯著增加[6]。

2 苯并[α]芘的性質(zhì)及暴露對(duì)水產(chǎn)品的危害

苯并[α]芘，是含苯環(huán)的稠環(huán)芳烴，分子式為C20H12，相對(duì)分子質(zhì)量為252.32。苯并[α]芘是高活性分子，具有很強(qiáng)的致畸性、致癌性和致突變性，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為I類(lèi)致癌物[7]。研究[8]表明，低濃度苯并[α]芘暴露會(huì)使水產(chǎn)品體內(nèi)自由基的生成與消除失衡，引發(fā)機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性作用；隨著苯并[α]芘暴露濃度繼續(xù)升高，水產(chǎn)品體內(nèi)自由基持續(xù)積累，機(jī)體損傷加重。苯并[α]芘暴露會(huì)對(duì)水產(chǎn)品肝、腎抗氧化和非特異性免疫能力及組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定程度的負(fù)面影響[9]。

陳好[10]以貝類(lèi)馬氏珠母貝為研究對(duì)象，研究了苯并[α]芘暴露對(duì)貝類(lèi)的毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，苯并[α]芘暴露對(duì)馬氏珠母貝的個(gè)體發(fā)育、免疫系統(tǒng)、脅迫應(yīng)答、代謝途徑等方面均具有毒性效應(yīng)，且馬氏珠母貝消化腺和鰓組織對(duì)苯并[α]芘暴露的響應(yīng)具有組織特異性。崔倩[11]以海水青鳉為研究對(duì)象探討了苯并[α]芘暴露后青鳉肝細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的免疫毒性機(jī)制，苯并[α]芘暴露產(chǎn)生的活性氧對(duì)免疫信號(hào)通路NF-κB有抑制作用。李丹妮[12]研究了苯并[α]芘暴露對(duì)中華絨螯蟹機(jī)體內(nèi)I相代謝酶CYP基因(CYP2A、CYP2B、CYP4)和II相代謝酶GST基因及其相關(guān)酶的響應(yīng)情況，苯并[α]芘暴露可誘導(dǎo)CYP2A、CYP2B、CYP4基因的表達(dá)，并呈現(xiàn)出顯著濃度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)，苯并[α]芘暴露對(duì)中華絨螯蟹的肝組織具有明顯的損傷作用。林芳等[13]將翡翠貽貝胚胎暴露于苯并[α]芘中，利用綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)對(duì)苯并[α]芘暴露的綜合毒理效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，苯并[α]芘脅迫顯著影響?hù)浯滟O貝胚胎抗氧化酶和非特異性免疫酶的活性。潘魯青等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在高濃度的苯并[α]芘暴露下，櫛孔扇貝表現(xiàn)出抗雌激素效應(yīng)而造成生殖毒性。苯并[α]芘暴露能夠延緩櫛孔扇貝的性腺發(fā)育，損傷卵巢。

由此可見(jiàn)，苯并[α]芘是一種在體內(nèi)反應(yīng)較為復(fù)雜的化合物，苯并[α]芘暴露會(huì)造成慢性中毒。此外，水生生物所攝取的苯并[α]芘會(huì)發(fā)生富集，并在較高級(jí)生物體內(nèi)更高倍數(shù)的富集[15]。通過(guò)飲食暴露，苯并[α]芘會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物腦、肺和結(jié)腸的氧化應(yīng)激[16]，可誘發(fā)肺癌和結(jié)腸癌，造成遺傳毒性。苯并[α]芘暴露不僅對(duì)水產(chǎn)品危害非常嚴(yán)重，食用含有苯并[α]芘的水產(chǎn)品還會(huì)嚴(yán)重影響人體健康和生命安全。世界各國(guó)或組織對(duì)食品中苯并[α]芘的殘留量進(jìn)行了非常嚴(yán)格的限制，制定了苯并[α]芘的限量標(biāo)準(zhǔn)。GB 2762—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》規(guī)定水產(chǎn)動(dòng)物及其制品(熏、烤水產(chǎn)品)中苯并[α]芘的最大殘留限量為5.0 μg/kg，苯并[α]芘的檢測(cè)是食品質(zhì)量安全的重點(diǎn)工作。

3 苯并[α]芘的檢測(cè)方法

3.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法(HPLC)是一種較先進(jìn)的檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)的分離、檢測(cè)和分析[17]。彭小東等[18]以乙腈飽和的正己烷—正己烷飽和的乙腈為萃取試劑，采用液相萃取—反相高效液相色譜法對(duì)植物油中苯并[α]芘含量進(jìn)行測(cè)定，檢出限為0.40 μg/kg。液相萃取避免了使用固相萃取成本高、自制層析柱柱效不穩(wěn)定的問(wèn)題。黃坤等[19]建立了基于HPLC的大米和小麥粉中苯并[α]芘的檢測(cè)方法。環(huán)己烷提取濃縮后用Phenomenex Luna C18色譜柱分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，方法檢出限和定量限分別為0.10，0.30 μg/kg。黃鸞玉等[20]建立了基于HPLC熒光法測(cè)定水產(chǎn)品中苯并[α]芘的方法，樣品以正己烷為提取劑，采用Florisil固相萃取柱凈化、蒸發(fā)濃縮，熒光檢測(cè)器檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)297 nm，發(fā)射波長(zhǎng)405 nm)，方法最低檢測(cè)限為0.09 μg/kg。HPLC檢測(cè)方法準(zhǔn)確度高，但是食品樣品成分復(fù)雜、前處理選擇性差、難以有效識(shí)別。

杜金鳳等[21]建立了超聲萃取-HPLC方法測(cè)定黑參中的苯并[α]芘。以正己烷為萃取劑，分子印跡固相萃取柱為凈化柱，熒光檢測(cè)器檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)410 nm)，檢出限為0.20 μg/kg。王麗君等[22]建立一種分子印跡固相萃取柱-HPLC測(cè)定植物油中苯并[α]芘含量的方法。分子印跡技術(shù)(MIT)是模擬酶—底物或抗體—抗原之間的相互作用，對(duì)印跡分子進(jìn)行專(zhuān)一識(shí)別的技術(shù)。MIT具有預(yù)定性、識(shí)別性和實(shí)用性，在色譜分離和固相萃取等方面被廣泛應(yīng)用[23]。植物油中苯并[α]芘經(jīng)正己烷溶解，通過(guò)分子印跡柱吸附，二氯甲烷洗脫，C18反相色譜柱分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)384 nm，發(fā)射波長(zhǎng)406 nm)，檢出限為0.10 μg/kg。MIT的引入，使得該方法特異性強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定。林亞楠等[24]合成了苯并[α]芘分子印跡固相萃取填料，并以此建立了煙熏鱘魚(yú)中苯并[α]芘的超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定方法?；贛IT的HPLC檢測(cè)方法抗干擾能力強(qiáng)，能選擇性提取目標(biāo)物，與傳統(tǒng)HPLC法相比，該方法的檢出限更低。

3.2 氣相色譜法

氣相色譜法(GC)是指用氣體作為流動(dòng)相的色譜法，是檢測(cè)揮發(fā)性有機(jī)物的強(qiáng)有力技術(shù)手段。質(zhì)譜分析法(MS)是一種測(cè)量離子質(zhì)荷比(質(zhì)量/電荷比)的分析方法，通過(guò)對(duì)試樣中各組分離子基團(tuán)的鑒定可獲得極高的靈敏性。將GC和MS有機(jī)整合連接起來(lái)，能夠做到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜化合物有效分離的同時(shí)對(duì)未知成分進(jìn)行分析檢測(cè)[25]。楊玲等[26]對(duì)比了GC-MS和HPLC兩種方法對(duì)苯并[α]芘的檢測(cè)。兩種方法均能很好的滿(mǎn)足環(huán)境水樣中苯并[α]芘的分析要求。王磊等[27]運(yùn)用在線(xiàn)凝膠滲透色譜(GPC)-GC-MS技術(shù)集合選擇離子掃描模式，建立了一種花生油樣品中苯并[α]芘殘留檢測(cè)的方法?；贕PC對(duì)花生油樣品進(jìn)行分離凈化，采用GC-MS檢測(cè)，具有抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)、靈敏度高、分析速度快的優(yōu)點(diǎn)。

3.3 表面增強(qiáng)拉曼光譜法

表面增強(qiáng)拉曼光譜法(SERS)是一種利用光的拉曼散射效應(yīng)來(lái)對(duì)目標(biāo)組分進(jìn)行痕量分析的技術(shù)[28-30]。肖海波[31]以制得的苯膦酸鋯包金(Au@ZrPP)核殼結(jié)構(gòu)作為SERS基底檢測(cè)苯并[α]芘。內(nèi)核納米粒子電磁場(chǎng)具有表面增強(qiáng)拉曼光譜活性，表層大量苯環(huán)與苯并[α]芘分子中苯環(huán)存在π—π電子堆積作用，以此對(duì)苯并[α]芘進(jìn)行捕獲、預(yù)濃縮，降低檢出限。肖旺[32]制備了銀納米點(diǎn)陣列SERS活性基底，然后在其表面修飾一層硫醇分子，結(jié)合MIT實(shí)現(xiàn)了苯并[α]芘的快速分離和檢測(cè)。王珊[33]以檸檬酸三鈉還原氯金酸合成納米金顆粒，將其用于修飾經(jīng)氨基改性的硅烷化硅藻土型紅色擔(dān)體，制備了新型SERS基底應(yīng)用于苯并[α]芘的拉曼光譜檢測(cè)。與色譜法相比，SERS在檢出限或精密度上不具優(yōu)勢(shì)，但是SERS可以使用便攜式拉曼光譜儀，且測(cè)試時(shí)間短，有利于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[34]。

3.4 酶聯(lián)免疫吸附分析法

酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)是免疫學(xué)檢測(cè)的重要方法[35]。鄧安平[36]通過(guò)化學(xué)基團(tuán)修飾技術(shù)在苯并[α]芘的3個(gè)不同位點(diǎn)末端連接活性羧基基團(tuán)，以苯并[α]芘—牛血清白蛋白偶合物為免疫原對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，再將成功免疫的小鼠脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，在培養(yǎng)液中培養(yǎng)融合后的細(xì)胞，用間接ELISA篩選出合格的抗體并鑒定其特性，建立用于檢測(cè)苯并[α]芘的ELISA分析法。該方法的檢出限為0.02 μg/L，因此高效快速、特異性好、準(zhǔn)確度高。

3.5 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法(GICT)是利用硝酸纖維素膜的層析性能和納米材料的遷移性實(shí)現(xiàn)可視化快速檢測(cè)的一種技術(shù)。劉波等[37]通過(guò)合成功能化修飾羧基的苯并[α]芘半抗原，研發(fā)了一種基于GICT原理的苯并[α]芘快速檢測(cè)試紙條，該試紙條檢測(cè)限可達(dá)5～10 ng/mL，且該試紙條與大部分苯并[α]芘結(jié)構(gòu)類(lèi)似物無(wú)交叉反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)當(dāng)前食用油中苯并[α]芘的快速、準(zhǔn)確判定。

綜上所述，高效液相色譜法和氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用是直接分析定量法，具有靈敏度高、檢出限低的優(yōu)點(diǎn)，但是分析過(guò)程繁瑣復(fù)雜、工作量大，需要昂貴的儀器和較長(zhǎng)的分析周期。表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)無(wú)需樣品前處理，但定量結(jié)果不準(zhǔn)確。免疫分析法基于抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)，將抗體作為生物化學(xué)檢測(cè)器對(duì)待測(cè)物進(jìn)行分析，是快速篩選定性法，這種方法簡(jiǎn)單快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高，但是綜合成本較高，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此，開(kāi)發(fā)出高效且可靠的檢測(cè)方法并應(yīng)用于苯并[α]芘的檢測(cè)刻不容緩。

4 總結(jié)與展望

苯并[α]芘具有高度致癌性且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，容易通過(guò)各種途徑對(duì)水產(chǎn)品及其制品造成污染，與苯并[α]芘相關(guān)的水產(chǎn)品質(zhì)量安全問(wèn)題已引起人們的廣泛關(guān)注。研究者已經(jīng)對(duì)苯并[α]芘暴露對(duì)水產(chǎn)品的毒性效應(yīng)進(jìn)行了大量研究，并取得了較大進(jìn)展，但是有關(guān)苯并[α]芘暴露引起的氧化應(yīng)激作用機(jī)理、雌激素效應(yīng)以及內(nèi)分泌干擾作用機(jī)制等問(wèn)題仍需要進(jìn)一步深入研究。

目前常用于檢測(cè)苯并[α]芘的方法包括色譜法、光譜法和免疫分析法等。色譜法基于苯并[α]芘進(jìn)行直接分析，準(zhǔn)確度高、精密度好，但是需要昂貴的設(shè)備，且檢測(cè)步驟繁瑣、耗時(shí)；免疫分析法可實(shí)現(xiàn)苯并[α]芘的快速可視化檢測(cè)，但仍需對(duì)樣品中主要雜質(zhì)進(jìn)行分離，且此類(lèi)檢測(cè)是基于反應(yīng)動(dòng)力學(xué)抑制的間接分析法，檢測(cè)耗時(shí)仍然較長(zhǎng)，同時(shí)無(wú)法精確定量；光譜法是基于苯并[α]芘分子結(jié)構(gòu)信息，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、原位探測(cè)，且數(shù)據(jù)處理簡(jiǎn)單，靈敏度、準(zhǔn)確率高，可滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求，但是該方法技術(shù)還不夠成熟。鑒于水產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜，上述方法在用于水產(chǎn)品中苯并[α]芘檢測(cè)時(shí)還存在許多問(wèn)題。隨著分析化學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，對(duì)于水產(chǎn)品中苯并[α]芘的檢測(cè)手段，可集中在樣品前處理上，配套改進(jìn)儀器分析條件來(lái)提高分離度，以降低檢出限。開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)基于不同機(jī)理的水產(chǎn)品中苯并[α]芘快檢試劑盒，用于水產(chǎn)品活體現(xiàn)場(chǎng)快檢，在水產(chǎn)品流入市場(chǎng)前獲得準(zhǔn)確結(jié)果將是未來(lái)發(fā)展方向之一。