松墨天牛腸道微生物研究進(jìn)展

時(shí)增增， 吳巖鎮(zhèn)， 林志藝*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院/生態(tài)公益林重大有害生物防控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002；2.福建省福州市連江縣林業(yè)局，福州 350100)

1 引 言

松墨天牛(MonochamusalternatusHope)是一種樹干侵入性甲蟲，是松材線蟲病的主要傳播媒介，在我國(guó)南方多個(gè)省市都有分布[1]。松材線蟲病是我國(guó)的一種重要的林業(yè)檢疫性病害，該病自傳入我國(guó)以來(lái)，對(duì)我國(guó)林業(yè)系統(tǒng)已經(jīng)造成了重大的危害，所以又被稱為松樹的“癌癥”。松墨天牛對(duì)松樹的取食不會(huì)造成松樹的大量死亡，但它所攜帶的大量的松材線蟲分泌的化學(xué)物質(zhì)對(duì)松樹有致命的傷害[2]。目前對(duì)松墨天牛的防治追求物理、化學(xué)、生物相結(jié)合的綜合防治。在物理防治上，主要采用去除疫木、切斷傳染源等措施；在化學(xué)防治上，主要是利用注干劑、無(wú)人機(jī)進(jìn)行藥物的輸入[3]。生物防治主要是開(kāi)發(fā)生物毒素、天敵等進(jìn)行天牛種群的控制。

腸道微生物是指生活在宿主腸段內(nèi)微生物的總稱，不同昆蟲體內(nèi)腸道微生物具有不同的種群規(guī)模[4]。腸道微生物在宿主新陳代謝、生長(zhǎng)發(fā)育等多方面發(fā)揮著重要作用。許多研究表明蛀干害蟲腸道擁有豐富微生物種群，其數(shù)量比昆蟲自身細(xì)胞的總數(shù)還多[5-6]。隨著16S rDNA基因測(cè)序、宏基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)的運(yùn)用更進(jìn)一步的擴(kuò)寬了人們探究腸道微生物的視野[7]

2 松墨天牛腸道菌群的特征

2.1 松墨天牛腸道微生物群落組成

松墨天牛腸道微生物占主要地位的是細(xì)菌。胡霞等人發(fā)現(xiàn)我國(guó)室外松墨天牛幼蟲的腸道優(yōu)勢(shì)菌是變形菌門(Proteobacteria)[8]。陳宏建等人運(yùn)用16S rDNA 的高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在門的水平上，無(wú)論是在野生還是飼養(yǎng)條件下，松墨天牛腸道菌群的優(yōu)勢(shì)門均為變形菌門和厚壁菌門(Firmicutes)。且在室內(nèi)人工飼養(yǎng)的情況下，變形菌門占有更大的豐度。這與胡霞等人的研究一致，說(shuō)明國(guó)內(nèi)野外條件下松墨天牛腸道的優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)穩(wěn)定。通過(guò)對(duì)OTUs 組成和 Alpha 多樣性的分析表明，室內(nèi)飼養(yǎng)的松墨天牛成蟲具有更多的腸道菌群[9]。在屬水平上，國(guó)內(nèi)的松墨天牛成蟲腸道中占據(jù)主要地位的是腸桿菌屬(Enterobacter)。在國(guó)外的研究中，克呂沃爾菌屬(Kluyvera)是主要的室外成蟲腸道菌群，沙雷氏菌、腸桿菌屬、無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)和紅球菌屬(Rhodococcus)是主要室內(nèi)種群的腸道菌群，結(jié)果與國(guó)內(nèi)存在差異，這與國(guó)內(nèi)外松墨天牛生活環(huán)境不同有關(guān)[10]。

2.2 松墨天牛腸道微生物群落結(jié)構(gòu)特征

昆蟲的腸道分為前腸、中腸和后腸，不同位置的腸道擔(dān)任的生理功能不同，隨著不同腸段擔(dān)任的主要功能不同，其所富集的微生物的種群與豐度也有差異[11]。陳宏建等人利用Illumina HiSeq技術(shù)對(duì)松墨天牛幼蟲腸道細(xì)菌的16S rDNA V3-V4區(qū)序列進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，在OTUs水平上，前腸OTUs最少,后腸OTUs最多[12]。這表明，在松墨天牛的腸道中，菌落最豐富的是后腸，這也說(shuō)明了在松墨天牛中后腸是主要的消化腸段。在松墨天牛幼蟲的5個(gè)齡期中，腸道微生物在門的水平上是相似的，但前2個(gè)齡期的細(xì)菌種多樣性顯著高于后面的齡期，這與松墨天牛前期生活在具韌皮部與木質(zhì)部的交接層，后期生活在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)單一的木質(zhì)部是分不開(kāi)的。

2.3 松墨天牛腸道菌群的變化規(guī)律

松墨天牛是完全變態(tài)類昆蟲，生活周期包括卵、幼蟲、蛹、成蟲4個(gè)時(shí)期。綜合國(guó)內(nèi)外對(duì)松墨天牛幼蟲與成蟲的研究，幼蟲與成蟲的優(yōu)勢(shì)菌在門的水平上差別不大，在屬的水平上主要差異在于次優(yōu)勢(shì)菌。在國(guó)內(nèi)松墨天牛幼蟲腸道菌群主要是變形菌門，優(yōu)勢(shì)菌包含腸桿菌屬、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)和沙雷氏菌屬(Serratia)，這與Kim等[10]發(fā)現(xiàn)一致，但不同的是變形菌門所占比不同，并且屬的水平上是以布丘氏菌屬(Buttiauxella)、紅球菌屬(Rhodococcus)為主。在松墨天牛的成蟲中，國(guó)內(nèi)松墨天牛成蟲腸道也是以變形菌門的腸桿菌屬為主，而國(guó)外松墨天牛成蟲腸道中則以克呂沃爾菌屬(Kluyvera)為主。

3 松墨天牛腸道微生物的功能

3.1 維持腸道內(nèi)生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)

后生動(dòng)物腸道里的微生物群落,參與宿主生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和免疫等廣泛的生理活動(dòng)[13]。松墨天牛在取食的過(guò)程中，一些微生物會(huì)隨著食物的進(jìn)入并定植在其腸道中。這些定植在松墨天牛體內(nèi)的微生物，部分承擔(dān)著為松墨天牛降解難以消化的食物；部分則與松墨天牛相互作用調(diào)控天牛生長(zhǎng)發(fā)育[14]。如松墨天牛腸道微生物可以幫助天牛進(jìn)行糖類和氨基酸的代謝。共生微生物作為天牛的得力助手，不僅能幫助天?？朔举|(zhì)纖維素、抵御病原菌還具有固氮等功能[15]。這些微生物為松墨天牛提供的便利，讓其在競(jìng)爭(zhēng)與生存方面獲得優(yōu)勢(shì)。

3.2 促進(jìn)松墨天牛分解消化

木質(zhì)纖維素是松墨天牛能主要攝取的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。若要以木質(zhì)素為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，僅依靠其自身的消化能力是不夠的，胡霞等人通過(guò)可培養(yǎng)的方法在松墨天牛幼蟲腸道中共篩選出能降解木質(zhì)纖維素的菌株154株，其中叢毛單孢菌(Comamonaskoreensis)和噬纖維細(xì)菌(Siphonobacteraquaeclarae)具有較強(qiáng)降解能力[16]。松墨天牛主要以馬尾松為食，馬尾松含氮量極低，氮素的缺乏對(duì)松墨天牛是一種需要突破的挑戰(zhàn)。謝谷艾等[17]用Ashby 培養(yǎng)基篩選出9種松墨天牛幼蟲腸道中的含有固氮作用的細(xì)菌，包括腸桿菌屬(EnterobacterHormaecheandEdwards, 1960)、氣球菌屬 (AerococcusWilliams,HitchandCowan, 1953)、檸檬酸桿菌屬(CitrobacterWerkmanandGillen, 1932)、固氮菌屬(Azotobacter)等。腸道微生物幫助松墨天牛解決了碳、氮等元素缺乏、難獲取等問(wèn)題，這為松墨天牛在一個(gè)地區(qū)的生存及繁衍提供了直接的保障。

3.3 抵御病原體

松墨天牛成蟲因其具翅能飛、活動(dòng)能力強(qiáng)，所以能接觸到很多微生物，其中能侵入并使其致病的病原菌也有很多。如白僵菌(Beauveria)、蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)、粘質(zhì)沙雷氏菌(SerratiamarcescensBizio)等。為了增強(qiáng)自身對(duì)環(huán)境的適應(yīng)，昆蟲腸道進(jìn)化出了很多防御機(jī)制，如雙氧化酶 DUOX 介導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)和 Imd 信號(hào)通路產(chǎn)生的抗菌肽 (antimicrobial peptides，AMPs)[18]。在 DUOX 途徑中，細(xì)菌可以分泌激活 DUOX 介導(dǎo)產(chǎn)生 ROS的非肽聚糖配體尿嘧啶[21]。在Imd途徑中，宿主體內(nèi)的微生物可以識(shí)別受體和免疫防御機(jī)制，這些特異性的微生物受體，是其共生菌在與宿主長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中的一種保護(hù)機(jī)制[20]。另外在富集大量細(xì)菌的馬氏管中，也能產(chǎn)生許多免疫類物質(zhì)幫助昆蟲抵御病原微生物的入侵。

4 展望及總結(jié)

隨著松墨天牛腸道微生物研究的深入，可以從其腸道內(nèi)獲得啟發(fā)，實(shí)現(xiàn)“以菌治蟲”。腸道微生物不僅本身一定的殺蟲潛力，其還能產(chǎn)生一些具有殺蟲活性的物質(zhì)，如蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的具有較好殺蟲活性的內(nèi)毒素——伴胞晶體[21]。以“以菌治蟲”的靈感主要來(lái)自被菌感染的蟲子尸體，如吳松青等人分離出的 BRC-CXG2 菌株能產(chǎn)生靈桿菌素，這可以作為Bti LLP29胞晶混合液的增效劑[22]；牟亞妮等人在松墨天牛尸體中分離的銅綠假單胞菌對(duì)天牛幼蟲具有殺蟲活性[23]；運(yùn)用松墨天牛腸道中的優(yōu)勢(shì)菌屬作為工程菌，攜帶Bt Cry3Aa毒素，可以對(duì)其產(chǎn)生良好的殺蟲效果。在昆蟲的腸道中，微生物之間存在著一些巧妙的互作關(guān)系。在同為入侵性甲蟲的紅脂大小蠹中，周等人研究發(fā)現(xiàn)小蠹蟲幼蟲和其伴生真菌對(duì)優(yōu)勢(shì)糖原的獲取存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，這會(huì)嚴(yán)重影響小蠹蟲幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，但小蠹蟲的腸道細(xì)菌Serratialiquefa-ciens、Rahnellaaquatilis和Pseudomonas產(chǎn)生的氨氣會(huì)改變半生真菌的糖原消耗順序，緩解其對(duì)小蠹蟲糖原的競(jìng)爭(zhēng)[24]。這種巧妙的細(xì)菌與真菌之間的關(guān)系，對(duì)幼期的小蠹蟲是非常有利的。徐等人發(fā)現(xiàn)被清除了腸道細(xì)菌的小蠹蟲更容易被白僵菌侵染致死，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，這其中的關(guān)鍵在于歐文氏菌(Erwinia)的有無(wú)[25]。這種利用昆蟲腸道內(nèi)細(xì)菌與真菌之間的互利或拮抗關(guān)系有助于進(jìn)一步利用微生物來(lái)防治有害昆蟲。

綜上所述，松墨天牛的腸道微生物種類復(fù)雜多樣，且在松墨天牛生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。國(guó)內(nèi)不同地區(qū)松墨天牛的主要腸道微生物差別不大，但國(guó)內(nèi)與國(guó)外松墨天牛腸道里的優(yōu)勢(shì)菌群存在較大差異，這跟松墨天牛所取食環(huán)境相關(guān)。松墨天牛因其主要生活在韌皮部之內(nèi)，防治困難，因此物理、化學(xué)、生物等防治手段相結(jié)合才能發(fā)揮最大的殺蟲效果。在松墨天牛的防控中，可以繼續(xù)挖掘其腸道微生物的功能，為創(chuàng)造新的工程菌提供參考。