Keap1/Nrf2在非小細胞肺癌治療抵抗中的作用

高 萌 翟乃亮

濱州醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院呼吸內(nèi)科 山東 濱州 256603

肺癌目前是腫瘤相關(guān)死亡的首要原因，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者的5年生存率僅為26%，而存在轉(zhuǎn)移的患者存活率更低，僅為6%，晚期的NSCLC患者可以通過放化療相結(jié)合的方式來延長生存時間，靶向治療和各種免疫療法的應(yīng)用，在臨床上取得了實質(zhì)性的進展[1]。但是NSCLC平均非同義突變負擔(dān)很高，僅有部分患者可以從靶向治療中獲益，酪氨酸激酶抑制劑及免疫治療藥物耐藥后治療方案的選擇非常困難，部分患者甚至?xí)诿庖咧委熀蟪霈F(xiàn)過度進展[2-3]，因此晚期NSCLC及耐藥患者的治療是目前臨床上的難點和熱點。

核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)是氧化應(yīng)激過程中的重要因子之一，在蛋白水平上接受Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)調(diào)控，通過維持氧化還原動態(tài)平衡，發(fā)揮抗炎及抗癌活性。但是Keap1/Nrf2途徑可以被腫瘤細胞劫持，一方面可以引起腫瘤的生長和侵襲性增加，另一方面腫瘤細胞可以利用Nrf2介導(dǎo)的解毒機制引起治療抵抗。在NSCLC中，Keap1/Nrf2突變在驅(qū)動基因陰性的腺癌中富集，也與EGFR、KRAS、STK11(LKB1)、TP53等基因突變密切相關(guān)。攜帶Keap1/Nrf2突變的NSCLC患者多存在轉(zhuǎn)移[4-5]。Tsakonas等[6]研究提出Nrf2+/CK+細胞密度高的NSCLC患者早期中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移風(fēng)險更高。Nrf2及其相關(guān)通路異常與晚期NSCLC放化療抵抗、免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)及酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)耐藥密切相關(guān)，成為NSCLC一種特殊的臨床表型[5-7]。本文主要探討了Keap1/Nrf2通路的理論基礎(chǔ)及Nrf2在肺癌治療抵抗中的研究進展，為NSCLC的治療探索新的方向。

1 Keap1/Nrf2信號通路

Nrf2是1994年Moi等人利用串聯(lián)重復(fù)序列作為識別位點探針從K562細胞中篩選Agtll cDNA 表達文庫分離出來的DNA結(jié)合蛋白之一，其由Nfe2l2基因編碼，屬于bZIP堿性亮氨酸拉鏈(CNCbZIP)轉(zhuǎn)錄因子家族，由7個功能結(jié)構(gòu)域(Neh1～Neh7)組成，其中Neh1與v-MAF禽肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物或Jun蛋白(c-Jun，Jun-B和Jun-D)二聚化后激活一系列含有抗氧化反應(yīng)原件(antioxidant reaction elements，ARE)或者電泳體反應(yīng)原件的基因，行使生物功能[7]。這些下游基因可以分為三類：細胞內(nèi)氧化還原平衡蛋白如谷氨酸-半胱氨酸連接酶、血紅素加氧酶-1，外源代謝酶NAD、NAD(P)H-醌氧化還原酶1以及轉(zhuǎn)運蛋白如多藥耐藥相關(guān)蛋白等，參與多種細胞過程，如DNA修復(fù)、蛋白酶體組裝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞凋亡、細胞自噬、氧化還原調(diào)節(jié)、脂質(zhì)/碳水化合物代謝、鐵和血紅素代謝等[8]。

在正常條件下，Nrf2通過其Neh2結(jié)構(gòu)域中的ETGE和DLG基序與兩個Keap1錨定于肌動蛋白細胞骨架、富含半胱氨酸的蛋白分子相互作用，引起自身的泛素化。泛素化的Nrf2可以被26S蛋白酶體迅速降解，在細胞質(zhì)中維持在很低的水平[4]。負責(zé)Nrf2泛素化的主要有三種泛素連接酶復(fù)合物：CUL3-RBX1-Keap1、非Keap1依賴的SCF/β-TrCP和HMG-CoA還原酶降解蛋白(HMG-CoA reductase degrades protein，HRD1)。在這三種方式中，CUL3-RBX1-Keap1對于胞質(zhì)中的氧化/親電反應(yīng)更為敏感，CUL3作為支架蛋白，與Keap1的BTB結(jié)構(gòu)域結(jié)合，允許與E2泛素結(jié)合酶形成復(fù)合物，對CUL3的類泛素化修飾也可以引起Nrf2在細胞中的積累；β-TrCP與Neh6結(jié)合，在胞核或胞質(zhì)中發(fā)揮作用，對代謝變化更敏感，并受GSK3-β調(diào)節(jié)；HRD1局限于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并且僅在ER應(yīng)激期間發(fā)揮作用[7-8]。

當(dāng)細胞暴露于氧化應(yīng)激以及化學(xué)預(yù)防化合物中狀態(tài)下,親電體及ROS就會與傳感器半胱氨酸反應(yīng)，影響其構(gòu)象，避免了Nrf2被蛋白酶體系統(tǒng)降解，并且不同的化學(xué)物質(zhì)可以靶向不同的半胱氨酸殘基，進而形成“半胱氨酸密碼”的概念。除此之外，含ETGE蛋白的競爭性結(jié)合、蛋白-蛋白相互作用抑制劑、p62/SQSTM1水平升高、mTOR抑制劑和CUL3環(huán)E3連接酶抑制劑(即MLN4924)都可以破壞KEAP1-NRF2相互作用[9]。在NSCLC中，Keap1和Nfe2l2的突變通常是互相排斥的，Keap1突變體還會出現(xiàn)顯性-負性效應(yīng)，即突變的Keap1蛋白會對野生型Keap1蛋白質(zhì)產(chǎn)生負面影響[9]。

2 Keap1/Nrf2通路與NCLC治療抵抗

2.1 Keap1/Nrf2與化療 先前已有研究證實應(yīng)用RNAi沉默Nrf2可以提高NSCLC細胞對于化療藥物的敏感性，抑制Nrf2是對抗NSCLC化療耐藥的方式之一[6]。

Nrf2天然抑制劑以鴉膽子苦醇(Brusatol)為代表，還包括雷公藤甲素、胡蘆巴堿以及銀杏黃酮等多種藥物。在A549異種移植瘤中，Brusatol聯(lián)合順鉑引起的治療增敏是通過增強泛素化促進Nrf2降解，與Keap1的異位表達并無明顯相關(guān)性，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)在A549細胞蛋白質(zhì)組中，Brusatol可以迅速且有效的降低Nrf2以外的某些半衰期較短的蛋白質(zhì)，并且還可以調(diào)節(jié)核糖體復(fù)合體的功能，這種作用類似于蛋白質(zhì)翻譯抑制劑，提示Brusatol抑制Nrf2的作用缺乏特異性[13]。雷公藤甲素在A549細胞以及移植瘤中可通過影響Nrf2-AREs途徑使Nrf2在mRNA和蛋白水平上的顯著減少，提高化療敏感性，并且在低濃度即可有效抑制A549細胞生長，在無毒水平上可以有效靶向Nrf2途徑[14]。胡蘆巴堿通過抑制EGFR信號通路及其下游效應(yīng)因子ERK1/2激酶來抑制Nrf2的激活及核轉(zhuǎn)位，對抗順鉑誘導(dǎo)的EGFR磷酸化及Nrf2激活，改善化療療效[15]，作用機制類似的還有二甲雙胍[16]。銀杏黃酮是通過使Nrf2/血紅素加氧酶-1軸的失活觸發(fā)細胞鐵死亡以及促進順鉑誘導(dǎo)的線粒體膜丟失和細胞凋亡，增強順鉑療效[17]。Nrf2天然抑制劑的特異性較差，Singh等[18]通過高通量篩選方式選定的ML385對Keap1突變導(dǎo)致Nrf2功能增強的NSCLC細胞具有較強的特異性和選擇性，通過與Nrf2的N端堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域Neh1結(jié)合，干擾MAFG-Nrf2蛋白復(fù)合物與所調(diào)節(jié)的DNA序列的結(jié)合，增強化療藥物的細胞毒性，并且在原位NSCLC臨床前模型中ML385與卡鉑雙藥聯(lián)合有顯著療效。

Keap1/TP53雙突變的肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)與TP53單突變的腫瘤預(yù)后相似，Keap1單突變體的LUAD患者存活時間最短[9]，TUNG等的研究表明突變型P53可能是通過增加Sp1與Nrf2啟動子的結(jié)合來上調(diào)Nrf2轉(zhuǎn)錄引起順鉑耐藥，且Nrf2、Bcl-2以及Bcl-xl高表達時，順鉑的不良反應(yīng)更為顯著；但Nrf2可以通過促進諸如MDM2基因表達等方式來增加P53降解并影響野生型P53功能，并且MDM2基因可用于P53功能預(yù)測，故而野生型P53患者也可存在高Nrf2表達并引起治療抵抗[19]。RYL-687是一種新的喹諾酮化合物，可以誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生和Nrf2上調(diào)，從而引起NAD、NAD(P)H-醌氧化還原酶1的升高，并且促進NAD、NAD(P)H-醌氧化還原酶1與P53的物理作用，來抑制20S蛋白酶體對P53的降解[20]。帶有死亡結(jié)構(gòu)域的P53誘導(dǎo)蛋白是DNA損傷后p53的主要靶基因，Ji等[10]研究提示，其競爭性地與Keap1結(jié)合來減少Nrf2泛素化引起順鉑耐藥；但其可以通過形成含有Caspase-2和Raidd的P53誘導(dǎo)蛋白樣復(fù)合體促進細胞凋亡，引導(dǎo)P53誘導(dǎo)蛋白-Keap1的促凋亡功能是一種新的治療方向。

應(yīng)用microRNA或lncRNA靶向Nrf2是近年來新興的調(diào)節(jié)方式之一，以miRNA34a及miRNA-495為例，miRNA-34a是Nrf2和Bcl-2的直接抑制物，通過轉(zhuǎn)位至線粒體介導(dǎo)P53下游凋亡效應(yīng)；通過應(yīng)用透明質(zhì)酸納米顆粒包裹miRNA-34a對順鉑耐藥的A549細胞進行轉(zhuǎn)染，引起核DNA及線粒體DNA的表觀遺傳學(xué)狀態(tài)的改變，將細胞代謝由糖酵解能量代謝轉(zhuǎn)化至線粒體機制，引起氧化應(yīng)激增加、谷胱甘肽耗竭，誘導(dǎo)凋亡信號及腫瘤細胞死亡[11]。miR-495直接靶向Nrf2的3′-UTR端來影響Nrf2/ARE通路促進順鉑耐藥，可以應(yīng)用lncRNA UCA1作為miRNA-495的“分子海綿”來糾正耐藥發(fā)生[12]。

2.2 Keap1/Nrf2與放療 Keap1/Nrf2常引起細胞內(nèi)ROS減少導(dǎo)致放療抵抗。腫瘤抑制基因STK11(LKB1)是NSCLC中第二常見的突變基因，LKB1突變的NSCLC細胞中Nrf2活性增強，引起谷氨酸-半胱氨酸連接酶(glutamate-cysteine ligasecatalytic subunit，GCLC)的上調(diào)，催化谷氨酸產(chǎn)生谷胱甘肽，避免了ROS介導(dǎo)的損傷而產(chǎn)生放射抗性，應(yīng)用GLS抑制劑耗竭谷胱甘肽可以改善放療敏感性[21]。抑制谷氨酰胺代謝是一種肺癌細胞放療增敏的有效策略。

Sun等[22]研究提出Nrf2可以通過抗氧化以外的機制來保護細胞DNA。無論存不存在ROS情況下，敲除Nrf2有助于電離輻射(IR)的超敏反應(yīng)，在清除ROS條件下，DNA雙鏈斷裂(DSB)可以增加Nrf2蛋白水平，并誘導(dǎo)Nrf2蛋白募集至與ATR相互作用的DNA損傷位點，激活A(yù)TR-CHK1-CDC2信號通路，引起G2細胞周期停滯來促進DSB同源重組修復(fù)以保持基因組的穩(wěn)定性—這是Nrf2作為細胞周期調(diào)節(jié)因子所發(fā)揮的作用。二甲雙胍可以針對該途徑減少癌細胞的抗氧化能力的同時減少G2細胞周期停滯來對抗放療耐藥，但其體外試驗濃度遠高于臨床藥理濃度峰值，其臨床意義還有待研究[23]。

2.3 Keap1/Nrf2與免疫治療 Nrf2的負調(diào)控因子Keap1基因突變在小鼠模型中與免疫環(huán)境中CD8+T細胞以及NK細胞的低浸潤有關(guān)，但是晚期LUAD患者Keap1丟失與ICI療效之間的相關(guān)性不明[24]。Ricciuti等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在KRAS突變聯(lián)合STK11或Keap1突變的患者中，存在野生型KRAS沒有的免疫表型，并且Keap1突變是晚期KRAS突變的LUAD患者中ICIs抵抗的常見的獨立因素。KRASMUT/Keap1MUTLUAD顯示出I型干擾素和其它炎性細胞因子的正向調(diào)節(jié)因子下調(diào)，如TMEM173(STING)、DDX58、TLR4和TLR7，這與KRASMUT/STK11MUTLUAD的免疫特征不同。

Pten在肺癌中是一種腫瘤抑制因子，其與PI3K通路改變相關(guān)。Best等人通過Keap1f/f和Ptenf/f(K1P)小鼠發(fā)現(xiàn)Keap1和Pten共缺失可以通過戊糖磷酸途徑(pentose phosphate pathway，PPP)重編程促進人肺腺癌形成，并且在Keap1f/f/Ptenf/f荷瘤肺中發(fā)現(xiàn)一種免疫抑制微環(huán)境，與PD-L1高水平表達相關(guān)，且給予抗PD-L1/抗CTLA-4治療后可以觀察到自發(fā)性肺腫瘤消退[25]。Shen等[26]研究表明，LKB1(STK11)通過激活A(yù)MPK和Keap1/Nrf2信號通路上調(diào)NSCLC中PD-L1的表達；LKB1缺失產(chǎn)生的高代謝狀態(tài)誘導(dǎo)DNA高甲基化，從而進一步沉默依賴于干擾素的基因表達，并且在KRAS驅(qū)動的肺癌中建立免疫惰性腫瘤微環(huán)境。

Nrf2與NSCLC細胞的免疫環(huán)境存在相關(guān)性，存在Nrf2激活的LUAD患者，接受抗PD-L1治療的總體存活率較低；在LUSC中Nrf2的特征狀態(tài)對免疫或腫瘤細胞的PD-L1表達沒有影響，但是Nrf2表達特征與免疫表達特征之間存在負相關(guān)，Nrf2低表達的患者在接受阿替唑珠單抗聯(lián)合化療治療的效果優(yōu)于單獨化療[6]。

Scribble基因是一種抑癌基因，在NSCLC中Scribble水平與Nrf2/PD-L1在體內(nèi)及體外研究中都表現(xiàn)出負相關(guān)，ROS的缺失可以恢復(fù)Scribble過表達細胞系中PD-L1的表達。高表達Scribble的患者表現(xiàn)出更好的化療敏感性，而低表達Scribble的患者會有更高的PD-L1表達，應(yīng)用PD-1/PD-L1阻斷劑對這部分患者是更好的治療方案[27]。

2.4 Keap1/Nrf2與靶向治療 Keap1的失活與靶向EGFR、ALK、RTK-RAS-MAPK途徑藥物敏感性降低有關(guān)[9]。Park等[28]通過建立吉非替尼耐藥細胞株HCC827GRKU，也獲得了對阿法替尼和奧西美替尼的交叉耐藥性，該細胞株表現(xiàn)出含有ARE的基因表達增加，而并非通過繞過RTK信號通路激活EGFR的機制產(chǎn)生耐藥，并且Brusatol協(xié)同治療與導(dǎo)入野生型Keap1增強EGFR-TKIs敏感性的效果相同。在EGFR-TKIs耐藥的NSCLC細胞系中，Nrf2蛋白水平顯著增加，并且在HCC827ER和HCC827GR細胞中敲除Nrf2基因可以克服其對EGFR-TKIs的耐藥性，這種耐藥性的獲得與Nrf2上調(diào)Gpx4和SOD2有關(guān)，進而靶向Nrf2-Gpx4/SOD2通路是克服EGFR-TKIs耐藥的一種潛在策略[29]。

3 結(jié)語及展望

Keap1/Nrf2通路可以通過代謝重編程、抑制癌細胞凋亡、增強腫瘤干細胞自我更新能力等方式，誘導(dǎo)促生存基因表達及促進癌細胞增殖，與耐藥密切相關(guān)，其異常表達常提示治療抵抗及不良預(yù)后。Keap1/Nrf2在NSCLC中的研究具有非常重要的意義，其在NSLCL中突變頻率高，可以作為一種新的基因監(jiān)測方向；尤其Keap1與KRAS、TP53等基因存在共突變時，其對于腫瘤免疫微環(huán)境的影響對應(yīng)用ICIs可能具有指導(dǎo)意義；針對Keap1/Nrf2通路是改善治療抵抗的一個方向。Nrf2操縱著多種下游基因的表達，處于復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心，故而其在NSCLC治療抵抗中的作用機制具有多樣性，各機制之間的交叉有待于進一步探索。也因為這種復(fù)雜性，目前尚無針對于此通路的藥物應(yīng)用于臨床，具備廣闊的研究前景。