蒸桑寄生和寬筋藤藥材質(zhì)量標準的改進

劉 鑫 楊 雪 孫曉雪 王 昊 馬世威崔 方 趙 杰 張加余 王志斌 王少平

1 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 山東 煙臺 264003；2北京中研同仁堂醫(yī)藥研發(fā)有限公司 北京 100075

桑寄生為桑寄生科植物桑寄生Taxilluschinensis(DC.)Danser的干燥帶葉莖枝，具有祛風(fēng)濕、補肝腎、強筋骨、安胎元等功效[1]。它是我國常用傳統(tǒng)中藥材，最早可追溯到《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]。其寄主來源復(fù)雜、藥材基原來源多樣，自然狀態(tài)下，桑寄生的寄主可有桑樹、柳樹、夾竹桃、漆樹等多科多屬多種植物。某些寄主的桑寄生還擁有毒性，影響了桑寄生藥材使用效果甚至用藥安全[3]。桑寄生的炮制方法在古代炮制文獻中記載較少，《雷公炮炙論》中載：“(桑寄生)采得后，用銅刀和根、枝、莖細銼，陰干了任用。勿令見火”[4]。現(xiàn)今多用生桑寄生和酒桑寄生兩種，亦有地方炮制規(guī)范及研究采用蒸制[5]或醋制[6-7]。蒸法是中藥傳統(tǒng)炮制中常用方法之一，可以緩和生藥燥烈之性、去除毒性、增強藥性，同時便于制劑、貯藏[8]。現(xiàn)行《中國藥典》中只有生桑寄生的質(zhì)量規(guī)范，各地方中藥材質(zhì)量標準中也只有《福建省中藥飲片炮制規(guī)范》[5]中有蒸桑寄生的載錄。本研究對蒸桑寄生的炮制方法及質(zhì)量標準進行研究，將有助于豐富《藥典》內(nèi)容，為蒸桑寄生質(zhì)量標準的制定提供依據(jù)。

寬筋藤又名松根藤、大接筋藤、舒筋藤、牛掙藤、大松身，為防己科青牛膽屬植物中華青牛膽Tinosporasinensis(Lour.)Merr的干燥莖，具有舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)止痛作用，始載于清代嶺南本草《生草藥性備要》[9]。寬筋藤在民族醫(yī)學(xué)尤其是藏醫(yī)藏藥中最為常用，是藏族地區(qū)防治衰老的常用藥[10]，但其基礎(chǔ)研究不足，物質(zhì)基礎(chǔ)不明[11]?，F(xiàn)行《藥典》中尚未載錄寬筋藤藥材質(zhì)量標準，各地方中藥材標準[12-15]中對寬筋藤也多只是規(guī)范了顯微鑒別或顯色反應(yīng)鑒別。本研究采用顯微鑒別、薄層色譜鑒別以及水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物等項目的測定，對《藥典》相關(guān)質(zhì)量標準的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 顯微鏡(奧林巴斯株式會社)、中藥材粉碎機(吉首市中誠制藥機械廠)、分析天平(上海良平儀器儀表有限公司)、烘箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、水分測定儀(上海佑科儀器儀表有限公司)、恒溫水浴鍋(常州德科儀器制造有限公司)、超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2 藥物與試劑 甲酸、乙醇、甲苯、乙醚、乙酸乙酯(天津市富宇精細化工有限公司)，三氯甲烷(煙臺三和化學(xué)試劑有限公司)，甲酸乙酯、甲醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，水合氯醛(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司)，三氯化鋁(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，硫酸鈉(天津市北辰方正試劑廠)，乙酸鉛(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，3,5-二硝基苯甲酸(上海麥克林生化科技有限公司)(以上試劑均為分析純)。槲皮素對照品(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號BP1187)。10批次蒸桑寄生飲片及10批次寬筋藤飲片來源見表1、2。

表1 蒸桑寄生樣品收集情況

表2 寬筋藤樣品收集情況

1.3 實驗方法

1.3.1 顯微鑒別 將各批次蒸桑寄生或?qū)捊钐亠嬈梅鬯闄C制成粉末置于潔凈的載玻片上，加10%水合氯醛數(shù)滴，混勻后移至酒精燈火焰上5～6 cm處，勻速同方向搖晃并觀察水合氯醛沸騰情況，以邊緣微沸稍干向內(nèi)收縮為一次透化標準，重復(fù)透化2～3次；放涼，滴加1～2滴蒸餾水，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多余水分，進行顯微觀察。

1.3.2 定性鑒別

1.3.2.1 蒸桑寄生

1.3.2.1.1 樣品溶液的制備 取本品粉末5 g,加甲醇-水(1∶1)60 mL，加熱回流1 h，趁熱濾過，濾液濃縮至約 20 mL后，加水10 mL，再加稀硫酸約0.5 mL，煮沸回流1 h后，用乙酸乙酯振搖提取參2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，濃縮至約l mL，作為供試品溶液。

1.3.2.1.2 對照品溶液的制備 取槲皮素對照品，加乙酸乙酯溶解制成 0.5 mg/mL 溶液，作為對照品溶液。

1.3.2.1.3 薄層色譜方法考察 參照薄層色譜法(《藥典》2020年版[1]四部通則0502)試驗，對薄層色譜法各影響因素進行考察。硅膠板考察分別選取青島海洋和煙臺江友系列預(yù)制薄層板作為點樣材料；點樣量為1 μL，采用甲苯(水飽和)-甲酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)為展開劑進行展開。展開劑考察采用甲苯∶甲酸乙酯=5∶4、甲苯(水飽和)∶甲酸乙酯∶甲酸=5∶4∶1、甲苯:甲酸乙酯:甲酸=5∶4∶2作為展開劑，對蒸桑寄生各批次飲片的樣品溶液和槲皮素對照品溶液進行薄層試驗。點樣量的考察采用青島海洋預(yù)制硅膠G薄層板為薄層展開板，以甲苯(水飽和)∶甲酸乙酯∶甲酸=5∶4∶1作為展開劑，以蒸桑寄生各批次飲片、槲皮素對照溶液為研究對象，對點樣量進行考察，點樣量為0.5、1和3 μL。展開溫度的考察，在不同溫度下對各批次的蒸桑寄生薄層行為進行考察。飽和狀態(tài)考察，對蒸桑寄生各批次飲片的薄層展開進行飽和狀態(tài)考察，考察條件為展開前飽和30 min和展開前不飽和。

1.3.2.2 寬筋藤

1.3.2.2.1 樣品溶液的制備 取本品粉末l g，加乙醇 20 mL，加熱回流2 h，濾過，濾液濃縮至l mL，作為供試品溶液。

1.3.2.2.2 對照品溶液的制備 取寬筋藤對照藥材l g，加乙醇20 mL，加熱回流2 h，濾過，濾液濃縮至l mL，作為對照藥材溶液。

1.3.2.2.3 薄層色譜方法考察 參照薄層色譜法(《藥典》2020年版[1]四部通則0502)試驗，對薄層色譜法各影響因素進行考察。硅膠板考察分別選取青島海洋和青島譜科系列預(yù)制薄層板作為點樣材料；點樣量為15 μL，采用甲苯:乙酸乙酯:甲酸(6∶4∶1)為展開劑進行展開。展開劑考察采用甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(6∶4∶1)、甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=(5∶4∶1)、甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=(6∶4∶0.5)和甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=(7∶4∶1)作為展開劑，對寬筋藤各批次飲片和寬筋藤對照藥材溶液進行薄層試驗。點樣量考察采用青島譜科預(yù)制硅膠G薄層板為薄層展開板，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(6∶4∶1)作為展開劑，以寬筋藤各批次飲片、寬筋藤對照藥材為研究對象，對點樣量進行考察，點樣量為10、12、15和16 μL。展開溫度考察，在60℃、5℃和室溫下對各批次的寬筋藤薄層行為進行考察。飽和狀態(tài)考察，對寬筋藤各批次飲片的薄層展開進行飽和狀態(tài)考察，考察條件為展開前飽和30 min和展開前不飽和。

1.3.3 水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物含量考察 對10批次蒸桑寄生及10批次寬筋藤藥材飲片按《中國藥典》2020年版[1]四部通則0832第二法(烘干法)測定水分；按通則2302測定灰分、酸不溶性灰分；按通則2201采用水冷浸、水熱浸、乙醇冷浸、乙醇熱浸法測定浸出物。

1.3.4 蒸桑寄生飲片強心苷檢查 參照《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》2008年版[12]桑寄生飲片強心苷檢查項下方法對蒸桑寄生各批次飲片中的強心苷進行鑒別：取飲片粉末10 g，加80%乙醇50 mL，加熱回流30 min，過濾取濾液蒸干，熱水10 mL復(fù)溶，過濾，濾液加15 mL乙醚振搖提取4次，取水層加醋酸鉛飽和溶液至沉淀完全，過濾，濾液加10 mL乙醇，加硫酸鈉飽和溶液脫鉛，過濾，濾液加15 mL三氯甲烷振搖提取3次，合并有機層濃縮至1 mL。濃縮液點于濾紙上，干后滴加堿性3,5-二硝基苯甲酸溶液，觀察是否顯色。

2 結(jié)果

2.1 蒸桑寄生

2.1.1 顯微鑒別 蒸桑寄生飲片粉末呈淡黃棕色。鏡下觀察到4個蒸桑寄生的顯微特征：石細胞，星狀細胞，導(dǎo)管，草酸鈣結(jié)晶。石細胞類方形、類圓形，偶有分支，壁三面厚，一面薄，含草酸鈣方晶。纖維成束，直徑約17 μm。具緣紋孔、網(wǎng)紋及螺紋導(dǎo)管多見。屋狀毛分枝碎片少見(圖1)。

2.1.2 薄層色譜定性鑒別

2.1.2.1 硅膠板考察結(jié)果 青島海洋較煙臺江友薄層板的斑點清晰，且Rf值適中(圖2)。經(jīng)綜合考察，最終選擇青島海洋預(yù)制硅膠G薄層板。

2.1.2.2 展開劑考察結(jié)果 蒸桑寄生各批次飲片和對照品溶液在甲苯(水飽和)∶甲酸乙酯:甲酸=5∶4∶1展開劑下分離效果更好，且斑點清晰，Rf值適中(圖3)。因此，最終選擇甲苯(水飽和)∶甲酸乙酯∶甲酸=5∶4∶1作為展開劑。

圖1 蒸桑寄生飲片顯微結(jié)果

2.1.2.3 點樣量考察結(jié)果 0.5和1 μL點樣下薄層板斑點清晰，效果較好；3 μL點樣下斑點暗淡，分離效果欠佳(圖4)。因此，點樣量確定為1 μL。

2.1.2.4 展開溫度考察結(jié)果 在三個溫度下蒸桑寄生各批次樣品的薄層色譜展開效果差異不大(圖5)，因此，最終并未對展開溫度進行限定。

2.1.2.5 飽和狀態(tài)考察結(jié)果 經(jīng)展開前飽和后的蒸桑寄生各批次飲片薄層展開效果較好，未進行飽和后展開的斑點存在疊加現(xiàn)象(圖6)。因此，確定飽和條件為展開前飽和30 min。

1.為槲皮素對照品；2～6.不同批次蒸桑寄生飲片。

1.為槲皮素對照品；2～6.不同批次蒸桑寄生飲片。

1.為槲皮素對照品；2～6.不同批次蒸桑寄生飲片。

1.為槲皮素對照品；2～6.不同批次蒸桑寄生飲片。

1.為槲皮素對照品；2～6.不同批次蒸桑寄生飲片。

2.1.2.6 驗證試驗 依據(jù)以上方法考察結(jié)果，本研究采用以下條件對各批次蒸桑寄生進行驗證。薄層板采用青島海洋化工廠生產(chǎn)的預(yù)制硅膠G薄層預(yù)制硅膠板，厚度為0.20～0.25 mm，批號為20210323。展開劑為甲苯(水飽和):甲酸乙酯:甲酸=5∶4∶1。檢視噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)。在供試品色譜中，與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(圖7)。

1.為槲皮素對照品溶液；2～11.不同批次蒸桑寄生飲片。

2.1.3 水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物考察 10批次蒸桑寄生水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物測定結(jié)果見表3、4。根據(jù)10批樣品測定結(jié)果，本研究認為，蒸桑寄生水分不得過12.0%，總灰分不得過5.0%，酸不溶性灰分不得過1.0%，乙醇熱浸法浸出物限度為不得低于5.0 %。

2.1.4 強心苷檢查 蒸桑寄生強心苷檢查結(jié)果顯示，10批飲片均不顯紫紅色(圖8)，符合《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》下桑寄生質(zhì)量標準。

表3 蒸桑寄生水分、總灰分和酸不溶性灰分測定結(jié)果/%

表4 蒸桑寄生浸出物測定結(jié)果/%

2.2 寬筋藤

2.2.1 顯微鑒別 寬筋藤飲片粉末呈淺灰色。鏡下觀察到導(dǎo)管、木纖維、腺毛3個寬筋藤的顯微特征。木栓細胞表面觀多角形，淡黃棕色。網(wǎng)紋導(dǎo)管直徑為60～400 μm，螺紋導(dǎo)管直徑為15～30 μm。石細胞類圓形至多角形，直徑為20～40 μm，內(nèi)含草酸鈣方晶。木纖維壁具人字形紋孔。韌皮纖維成束，木化，周圍薄壁細胞含草酸鈣方晶，形成晶鞘纖維。淀粉粒單粒類圓形或橢圓形，直徑為3～20 μm。復(fù)粒少數(shù)，由2～3分粒組成(圖9)。

2.2.2 薄層色譜定性鑒別

2.2.2.1 硅膠板考察結(jié)果 青島海洋較煙臺江友薄層板的斑點清晰，且Rf值適中(圖10)。經(jīng)綜合考察，最終選擇青島海洋預(yù)制硅膠G薄層板。

圖8 蒸桑寄生強心苷鑒別結(jié)果

圖9 寬筋藤飲片顯微觀察結(jié)果

1、10.寬筋藤對照藥材；2～9、11、12.寬筋藤飲片。

2.2.2.2 展開劑考察結(jié)果 寬筋藤各批次飲片和對照藥材溶液在甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(6∶4∶1)展開劑下分離效果更好，且斑點清晰，Rf值適中(圖11)。因此，最終選擇甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(6∶4∶1)作為展開劑。

1.寬筋藤對照藥材；2～6.寬筋藤飲片。

2.2.2.3 點樣量考察結(jié)果 12、15和16 μL點樣下薄層板斑點清晰，效果較好，10 μL點樣下斑點暗淡，分離效果欠佳(圖12)。因此，點樣量確定為15 μL。

1.寬筋藤對照藥材；2～6.寬筋藤飲片。

2.2.2.4 展開溫度考察結(jié)果 在三個溫度下寬筋藤各批次樣品的薄層色譜展開效果差異較大。其中60℃下斑點不明顯，且分離度不佳，5℃下存在明顯的邊緣效應(yīng)導(dǎo)致斑點不整齊(圖13)。因此，最確定展開溫度為常溫。

1.寬筋藤對照藥材；2～6.寬筋藤飲片。

2.2.2.5 飽和狀態(tài)考察結(jié)果 經(jīng)展開前飽和后的寬筋藤各批次飲片薄層展開效果較好，未進行飽和后展開的斑點存在疊加和邊緣效應(yīng)現(xiàn)象(圖14)。因此，確定飽和條件為展開前飽和30 min。

2.2.2.6 驗證試驗 本研究依據(jù)以上方法考察結(jié)果，采用以下條件對各批次蒸桑寄生進行驗證。薄層板采用青島譜科化工廠生產(chǎn)的預(yù)制硅膠G薄層預(yù)制板，厚度為0.20～0.25 mm，批號為20210323。展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(6∶4∶1)。檢視噴以5%磷鉬酸乙醇溶液。在105℃下加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(圖15)。

1.寬筋藤對照藥材；2～6.寬筋藤飲片。

1～8、10、11. 寬筋藤飲片；9.寬筋藤對照藥材。

2.2.3 水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物考察 10批次寬筋藤飲片水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物考察結(jié)果見表5、6。根據(jù)10批樣品測定結(jié)果，本研究認為：寬筋藤水分不得過13.0%，總灰分不得過10.0%，酸不溶性灰分不得過5.0%，水熱浸法浸出物限度為不得低于10.0 %。

表5 寬筋藤水分、總灰分和酸不溶性灰分測定結(jié)果/%

表6 寬筋藤浸出物測定結(jié)果/%

3 討論

本研究通過觀察蒸桑寄生和寬筋藤飲片及粉末的顯微特征，掌握了顯微鑒定蒸桑寄生和寬筋藤的要點，為兩種藥材的顯微鑒別提供了參考。

本研究對薄層板廠家(青島海洋、青島譜科、煙臺江友)、點樣量(10、12、15、16 μL)、展開劑乙酸乙酯∶甲酸(6∶4∶1)、甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=(5∶4∶1)、甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=(6∶4∶0.5)和甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=(7∶4∶1)、展開溫度(5℃、常溫、60℃)飽和狀態(tài)(飽和、不飽和)等薄層色譜條件進行了考察，最終確定了蒸桑寄生和寬筋藤的薄層色譜鑒別方法，該方法方法色譜斑點清晰、專屬性強、穩(wěn)定性好、耐用性強。

本研究在對水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量測定的測定中，得出以下質(zhì)量標準：蒸桑寄生水分不得過12.0%，總灰分不得過5.0%，酸不溶性灰分不得過1.0%，乙醇熱浸法浸出物限度為不得低于5.0 %；寬筋藤水分不得過13.0%，總灰分不得過10.0%，酸不溶性灰分不得過5.0%，水熱浸法浸出物限度為不得低于10.0 %。

本研究通過對蒸桑寄生和寬筋藤進行顯微鑒別、薄層色譜鑒別、水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物和強心苷含量測定，系統(tǒng)地考察了兩種藥材的各項質(zhì)控指標，結(jié)合《藥典》和各地兩種藥材的質(zhì)量要求，制定了質(zhì)量標準，為今后兩種植物藥的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。