梯度淋洗離子色譜法同時(shí)測定西蘭花中6種無機(jī)陰離子

高 健 范寶莉 亢原彬 李 煜 李玉梅 尚云濤*

(1.天津師范大學(xué)，天津 300387；2.西南林業(yè)大學(xué)，昆明 650224； 3.天津渤海望亞涂料有限公司，天津 301735)

西蘭花是十字花科蕓薹屬重要經(jīng)濟(jì)作物，是我國人民餐桌上常見蔬菜，并廣泛種植于我國大部分地區(qū)如華北、中東部及東南沿海等。西蘭花營養(yǎng)成分豐富，富含多種抗氧化物質(zhì)、各類維生素、微量元素、膳食纖維及硫代葡萄糖苷等對人體健康有益的生物活性物質(zhì)[1]。

西蘭花中各種離子成分較為豐富。據(jù)報(bào)道，人體硝酸鹽總攝入量中蔬菜類食物所占比例較高[2]。研究表明，大量食用高硝酸鹽含量的蔬菜，可能導(dǎo)致胃癌、腸癌等惡性腫瘤發(fā)生率提高[3]。而人體攝入的硝酸鹽還可能在一定條件下被還原為危害性更強(qiáng)的亞硝酸鹽。亞硝酸鹽的氧化性較硝酸鹽強(qiáng)，如過量攝入可能會(huì)嚴(yán)重影響紅細(xì)胞供氧能力，甚至威脅生命[4]。亞硝酸鹽還是強(qiáng)致癌物亞硝胺的前體物質(zhì)，現(xiàn)已證實(shí)亞硝胺是多種癌癥的重要誘發(fā)因素[5]。在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，廣泛存在過量施用氮肥以達(dá)到增產(chǎn)目的，而大量施用的氮肥又直接導(dǎo)致了農(nóng)產(chǎn)品中硝酸鹽含量升高[6]。而農(nóng)產(chǎn)品采收后的儲(chǔ)藏、處理、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)也可能使其中的硝酸鹽含量升高。而十字花科類蔬菜因其特有的對氮元素吸收轉(zhuǎn)化特性，使得其農(nóng)產(chǎn)品中硝酸鹽含量可能較高[7]。西蘭花作為重要的十字花科蔬菜，其硝酸鹽和亞硝酸鹽等無機(jī)陰離子含量受到廣泛關(guān)注[8]。因此，建立一種西蘭花中各類無機(jī)陰離子的定量分析方法，將可以為完善蔬菜食品安全檢測及質(zhì)量控制提供檢測方法和技術(shù)。

據(jù)報(bào)道，氯離子、硝酸鹽、亞硝酸鹽、溴離子、硫酸鹽、磷酸鹽等無機(jī)陰離子的分析檢測技術(shù)有分光光度法[9]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法和離子色譜法[10]等。其中離子色譜法因其在定量分析、檢出限、分析效率等方面所具有的顯著優(yōu)勢，已在各類食品無機(jī)陰離子定性定量分析中得到廣泛應(yīng)用。李倩等[11]以KOH(30 mmol/L)為流動(dòng)相，建立了同時(shí)檢測果蔬中5種陰離子的方法。魯廣秋等[12]建立了超聲波輔助提取-離子色譜法檢測不同產(chǎn)區(qū)臭靈丹中4種無機(jī)陰離子含量的方法，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，分析效率高。魏泉增等[13]建立以碳酸鈉溶液(3.6 mmol/L)為淋洗液同時(shí)檢測茶葉中4種無機(jī)陰離子的方法，以高效、精確分析紅茶、綠茶中陰離子含量。目前，在食品檢測領(lǐng)域利用離子色譜梯度淋洗技術(shù)分析肉制品和香腸中的亞硝酸鹽和硝酸鹽并取得了理想的檢測效果[14]。植物樣品中離子成分較為復(fù)雜，且含量差異較大，在等度淋洗條件下樣品中某些高含量離子組份可能會(huì)對其他離子的定量分析產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。本研究采用梯度淋洗技術(shù)以有效提高各離子組份檢測靈敏度，改善定量分析準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為理想。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

本研究所用西蘭花均采購自農(nóng)貿(mào)市場或超市。

KCl、Na2SO4、NaNO3、NaNO2、NaBr、Na3PO4均為基準(zhǔn)試劑，甲醇(色譜純)；固相萃取小柱(C18，500 mg，3 mL)，超純水電阻率≥18.2 MΩ·cm。

1.2 儀器與設(shè)備

DIONEX ICS-2100型離子色譜儀、Supelco固相萃取儀、Milli-Q超純水機(jī)。

1.3 離子色譜分析體系

DIONEX Ion Pac AS11-HC(4 mm×250 mm)分析柱，DIONEX Ion Pac AG11(4 mm×50 mm)保護(hù)柱，4 mm AERS 500自動(dòng)再生抑制器，淋洗液流速1.0 mL/min，抑制器電流80 mA，25 μL定量環(huán)，KOH淋洗液在線發(fā)生器，淋洗液濃度梯度見表1，電導(dǎo)檢測器，柱溫箱溫度30 ℃。

表1 梯度淋洗程序

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精確稱取KCl、Na2SO4、NaNO3、NaNO2、NaBr、Na3PO4配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 樣品前處理

稱取20 g(精確至0.001 g)西蘭花，洗凈、破碎，加30 mL超純水研磨后定容至250 mL，超聲頻率20 kHz、超聲功率120 W，輔助提取15 min，再經(jīng)10 000 r/min 離心15 min，取離心后上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，收集濾液。C18固相萃取小柱加入10 mL甲醇、10 mL超純水活化，靜置15 min。將濾液以2～3 mL/min流速通過C18固相萃取小柱，舍棄最初洗脫的約3 mL洗脫液，收集剩余洗脫液后再次經(jīng)0.45 μm濾膜過濾進(jìn)行色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分析條件

離子色譜梯度淋洗液分離體系進(jìn)行優(yōu)化后最終確定淋洗液梯度程序如表1所示，流速為1.0 mL/min，抑制器電流80 mA為最適KOH梯度分析體系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該體系下6種無機(jī)陰離子色譜峰峰形較好，各組份間分離度高、干擾少，定量分析準(zhǔn)確度高(圖1、2)。

圖1 6種無機(jī)陰離子標(biāo)準(zhǔn)溶液離子色譜圖Figure 1 Ion chromatogram of 6 inorganic anions standard solution.

2.2 抑制器電流的選擇

抑制器作為離子色譜重要模塊可以顯著降低背景電導(dǎo)，提到檢測靈敏度。抑制器電流過低會(huì)導(dǎo)致背景電導(dǎo)升高，影響定量分析的精確性。而抑制器電流過高時(shí)雖可以達(dá)到較為理想的背景電導(dǎo)抑制效果，但可能降低抑制器壽命，增加檢測成本。本實(shí)驗(yàn)對離子色譜抑制器電流進(jìn)行了優(yōu)化，重點(diǎn)考察了抑制器電流50～100 mA條件下系統(tǒng)背景電導(dǎo)值，當(dāng)抑制器電流過低時(shí)系統(tǒng)背景電導(dǎo)明顯上升，當(dāng)抑制器電流過高時(shí)背景電導(dǎo)趨于平衡，過高的抑制器電流并沒有起到更好的抑制效果。本實(shí)驗(yàn)最終確定80 mA為最適抑制器電流，其在梯度淋洗濃度變化條件下有效降低背景電導(dǎo)值(見表2)，提升檢測靈敏度，又對抑制器有一定的保護(hù)作用，延長使用壽命。

圖2 西蘭花樣品離子色譜圖Figure 2 Ion chromatogram of broccoli sample.

表2 不同抑制器電流下背景電導(dǎo)變化范圍

2.3 亞硝酸鹽痕量分析

在采用等度淋洗離子色譜法分析亞硝酸鹽時(shí)，往往由于氯離子與亞硝酸鹽保留時(shí)間較為接近，兩者分離度較小，容易影響亞硝酸鹽檢測靈敏度。又因?yàn)槭卟藰悠分新入x子含量通常顯著高于亞硝酸鹽含量，造成亞硝酸鹽色譜峰極易被氯離子色譜峰遮蔽，影響亞硝酸鹽定量分析結(jié)果，甚至無法有效檢測亞硝酸鹽含量。

實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建離子色譜KOH梯度淋洗技術(shù)，提高了硝酸鹽及亞硝酸鹽檢測靈敏度。對比常規(guī)等度淋洗離子色譜法(KOH淋洗液濃度為30 mmol/L)，如圖3所示，當(dāng)氯離子與亞硝酸鹽濃度比為1∶100時(shí)亞硝酸鹽色譜峰峰形受到嚴(yán)重影響(圖3A)，檢測靈敏度降低，無法達(dá)到基線分離標(biāo)準(zhǔn)，此時(shí)亞硝酸鹽定量分析可能存在較大誤差；當(dāng)氯離子與亞硝酸鹽濃度比為1∶1000時(shí)，氯離子色譜峰甚至完全覆蓋亞硝酸鹽離子色譜峰(圖3B)，出現(xiàn)假陰性檢測結(jié)果。而采用梯度淋洗離子色譜法，如圖4所示，氯離子色譜峰與亞硝酸鹽色譜峰分離效果明顯改善，當(dāng)氯離子與亞硝酸鹽濃度比達(dá)到1∶1000，氯離子與亞硝酸鹽分離效果較為理想(圖4A)，當(dāng)氯離子與亞硝酸鹽濃度比達(dá)到1∶10000時(shí)，亞硝酸鹽仍可以達(dá)到基線分離標(biāo)準(zhǔn)，且峰形及分離度均較好(圖4B)，可見梯度淋洗法將顯著提升亞硝酸鹽檢測靈敏度。

圖3 等度淋洗法亞硝酸鹽離子色譜圖Figure 3 Equi-elution ion chromatogram of nitrite in broccoli.

圖4 梯度淋洗法亞硝酸鹽離子色譜圖Figure 4 Gradient elution ion chromatogram of nitrite in broccoli.

2.4 線性范圍及檢出限

根據(jù)6種陰離子系列標(biāo)準(zhǔn)溶液測試結(jié)果，以各陰離子組分峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)建立線性回歸方程，計(jì)算3倍信噪比作為各陰離子組分檢出限(見表3)。結(jié)果表明，6種陰離子組分線性相關(guān)系數(shù)為0.999 5～0.999 9，檢出限為0.021～0.036 mg/L，結(jié)果較為理想。

2.5 色譜體系驗(yàn)證

將西蘭花樣品平行測試5次，結(jié)果顯示6種無機(jī)陰離子保留時(shí)間及峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于1.5%；將5份西蘭花樣品分別處理后上機(jī)檢測，結(jié)果顯示6種無機(jī)陰離子保留時(shí)間及峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于2.5%。結(jié)果表明，該色譜體系精密度及重復(fù)性均較好。

將3份西蘭花樣品處理后分別添加一定濃度的陰離子標(biāo)樣，分別檢測樣品本底值和檢測值，計(jì)算并檢驗(yàn)方法回收率。6種無機(jī)陰離子回收率范圍95.7%～104%，回收率檢驗(yàn)效果理想(見表4)。

表3 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限

表4 樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

3 討論

本研究采用梯度淋洗離子色譜法，首先在最初的20.0 min內(nèi)KOH濃度為7 mmol/L，使氯離子等保留較弱的組分在這一階段被充分洗脫分離，而其他中強(qiáng)保留組分仍然保留在色譜柱中；而后在20.1 min時(shí)KOH濃度立刻上升至30 mmol/L，使中強(qiáng)保留組份得到良好分離。同時(shí)，淋洗液KOH濃度的梯度變化可以有效降低在等度淋洗條件下可能出現(xiàn)的亞硝酸鹽與氯離子的共洗脫效應(yīng)，提高了亞硝酸鹽與氯離子的分離度，避免了高濃度氯離子對亞硝酸鹽離子的遮蔽和干擾。西蘭花中含有比較豐富的多種化學(xué)和生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、維生素、色素、有機(jī)酸以及多種有機(jī)硫化合物等物質(zhì)。如果不經(jīng)過適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚碇苯舆M(jìn)行色譜分析，則極易對離子色譜柱、抑制器、檢測器等重要儀器模塊造成污染，直接影響分析準(zhǔn)確性，降低儀器及耗材使用壽命。本研究選用固相萃取小柱(C18)對西蘭花樣品進(jìn)行凈化處理，減少了各類有機(jī)物、色素等物質(zhì)對檢測結(jié)果可能產(chǎn)生的影響，同時(shí)又保證了較為理想的回收率，在一定程度上延長了色譜柱和抑制器的使用壽命，降低設(shè)備維護(hù)成本。

4 結(jié)論

建立了一種利用梯度淋洗離子色譜技術(shù)分析西蘭花中6種無機(jī)陰離子的檢測方法。采用KOH梯度淋洗技術(shù)，提高了各組份檢測靈敏度、檢出限低、峰形對稱性好、能夠?qū)崿F(xiàn)陰離子痕量分析、分析效率高、可以滿足西蘭花中多種無機(jī)陰離子高效、精確檢測需求。