髓系特異性Abro1基因敲除小鼠構(gòu)建和表型初步分析①

李亞婷 張 潔 尹榮華 楊曉明 任廣明 葛志強(qiáng)（天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系，天津 300072）

ABRO1（Abraxas brother 1）也稱為FAM175B，由415 個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量約為55 kD［1-3］。ABRO1作為一種支架蛋白，主要分布于細(xì)胞質(zhì)，通過(guò)與其他蛋白相互作用參與機(jī)體多種生理過(guò)程調(diào)節(jié)［4］。ABRO1 與MERIT40、BRE、BRCC36 相結(jié)合組裝成BRISC 復(fù)合體，可特異性去除K63 位鏈接的多聚泛素鏈［5-8］。同時(shí)，ABRO1 與去泛素化酶USP7 相互作用，可特異性去除p53 的K48 位鏈接的多聚泛素鏈［9］。此外，ABRO1還可作為轉(zhuǎn)錄輔因子與AP-1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)［10］。

ABRO1 在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ABRO1 與SHMT 蛋白結(jié)合，一方面介導(dǎo)BRISC 復(fù)合體對(duì)IFNAR1 的K63 位去泛素化，進(jìn)而啟動(dòng)干擾素通路［7］；另一方面，介導(dǎo)BRISC 復(fù)合體對(duì)病毒轉(zhuǎn)錄因子HIV-1 Tat 的K63 位去泛素化，調(diào)節(jié)病毒在T 細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制［11］。此外，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ABRO1介導(dǎo)BRISC 復(fù)合體對(duì)NLRP3 激活階段的K63 位去泛素化，進(jìn)而促進(jìn)NLRP3 炎癥小體活化，Abro1全基因敲除小鼠顯著抵抗LPS誘導(dǎo)的敗血癥以及尿酸鈉（sodium urate，MSU）導(dǎo)致的腹膜炎［12］。為進(jìn)一步揭示ABRO1在免疫調(diào)節(jié)中的潛在機(jī)制，課題組構(gòu)建了髓系特異性Abro1基因敲除小鼠。

本研究采用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)和Cre/LoxP 重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了髓系特異性Abro1基因敲除小鼠［13-15］。同時(shí)在基因組和蛋白水平對(duì)其進(jìn)行鑒定，并初步分析其表型，為后期研究ABRO1 在髓系細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Abro1flox/+小鼠由上海南方模式生物科技股份有限公司采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建；Lyz2-Cre+小鼠由上海南方模式生物科技股份有限公司贈(zèng)送（The Jackson Laboratory；# 004781；B6.129P2-Lyz2tm1（cre）Ifo/J）；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)繁殖，軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)審查通過(guò)（倫理號(hào)：IACUC-DWZX-2020-568）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 1640 培養(yǎng)基（#C11875500BT）、澳洲胎牛血清（#10270）購(gòu)自Gibco；Gelred 核酸染料（#EL108-01）、2×Taq PCR MasterMix（#MT201-01）購(gòu)自博邁德生物技術(shù)有限公司；Red Cell Lysis Buffer（#LSB03）購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；Mouse Inflammation Kit（#552364）購(gòu)自BD；蛋白酶K（#539480）購(gòu)自EMD Millipore corporation；LPS（#L7011）購(gòu)自Sigma；IL-1β ELSIA（#ab197742）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Abcam；Western blot抗體：anti-ABRO1（#NBP1-90282）購(gòu)自NOVUS；anti-GAPDH（#AC002）、HRP Goat Anti-Rabbit IgG（#WH157306）購(gòu)自ABclonal；流式抗體：anti-CD45-PE（#12-0451-82）、anti-CD11b-efluor450（#48-0112-82）、anti-Ly6C-PE-Cy7（#25-5931-82）、anti-Ly6G-APC（#17-5931-82）、anti-B220-APC（#17-0452-81）、anti-CD3-FITC（#14-0031-82）購(gòu)自eBioscience。

1.2 方法

1.2.1Abro1flox/+小鼠構(gòu)建Abro1flox/+小鼠采用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)將LoxP位點(diǎn)放置于Abro1基因2 號(hào)外顯子（exon2）區(qū)域兩側(cè)：通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄方式得到Cas9 mRNA 和gRNA；采用In-Fusion cloning 方法構(gòu)建同源重組載體（targeting vector），隨后將Cas9 mRNA、gRNA和targeting vector顯微注射至C57BL/6J小鼠受精卵，將長(zhǎng)片段PCR 鑒定結(jié)果為正確同源重組的小鼠與C57BL/6J小鼠交配，得到Abro1flox/+小鼠。

1.2.2Abro1flox/flox/Lyz2-Cre+小鼠繁殖Abro1flox/+小鼠構(gòu)建完成后進(jìn)行雌雄自交，子代篩選出Abro1flox/flox純合子小鼠。Abro1flox/flox與Lyz2-Cre+小鼠交配，子代得到Abro1flox/+/Lyz2-Cre+小鼠，將其與Abro1flox/flox交配，最終得到Abro1flox/flox/Lyz2-Cre+小鼠為髓系特異性Abro1基因敲除小鼠（myeloid-specificAbro1knockout mice，MKO 小鼠）；Abro1flox/flox/Lyz2-Cre-小鼠作為野生型小鼠（wild type mice，WT小鼠）。

1.2.3 鼠尾DNA 提取 剪取適齡小鼠鼠尾3 mm，置于無(wú)DNA 污染的1.5 ml EP 管，每支EP 管加入250 μl 鼠尾裂解液［100 mmol/L Tris-HCl（pH=8），200 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，0.2%SDS，100μg/ml蛋白酶K］，58℃水浴孵育2～12 h。12 000 r/min 離心10 min，取100 μl 上清轉(zhuǎn)移至新的EP 管。加入2.5 倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃沉淀DNA 30 min，12 000 r/min 離心10 min，棄上清，室溫靜置數(shù)分鐘使乙醇充分揮發(fā)，加入66μl 去離子水，渦旋振蕩充分溶解DNA。

1.2.4 PCR 反應(yīng)體系：DNA 模板1～2 μl、正反向引物各1μl（10μmol/L）、2×Taq PCR MasterMix 10μl，去離子水補(bǔ)齊至20μl。其中LoxP基因型鑒定正向引物：5'-ATCCTGCCATTGTCTGTATT-3'，反向引物：5'-CAAGCTGGTGTCATCTATTA-3'；Lyz2-Cre 基因型鑒定正向引物：5'-ATCGGTAGGAACTTCCTGTTTTGCACAC-3'，反向引物：5'-ATCCATCCATCCACACACACATCACTCT-3'。PCR 擴(kuò)增程序：LoxP基因型鑒定PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4℃5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃5 min；12℃10 min。Lyz2-Cre 基因型鑒定PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，34 個(gè)循環(huán)；72℃5 min；12℃10 min。

1.2.5 小鼠免疫細(xì)胞分離與培養(yǎng)

1.2.5.1 骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）分離和培養(yǎng) 選取8～10周齡WT 和MKO 小鼠，無(wú)菌環(huán)境中分離股骨和脛骨，6 ml生理鹽水沖出骨髓細(xì)胞，細(xì)胞篩過(guò)濾除去殘存肉沫，800 g 離心5 min，棄上清，1640 培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)完成后轉(zhuǎn)至含1640培養(yǎng)基+30%L929上清+10%胎牛血清的培養(yǎng)皿，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，共培養(yǎng)7 d，細(xì)胞分離完成后72 h、120 h 換液，培養(yǎng)完成后離心棄上清，加入適量上樣緩沖液并攪拌細(xì)胞沉淀使其充分裂解，煮樣，-20℃存儲(chǔ)備用。

1.2.5.2 中性粒細(xì)胞（neutrophils，NEU）分離 首先采用上述相同方法將小鼠骨髓細(xì)胞沖出，800 g 室溫離心5 min 后棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液（0.2%NaCl）重懸并裂解20 s，裂解完成后加入等體積紅細(xì)胞裂解終止液（1.6%NaCl）顛倒混勻，細(xì)胞篩過(guò)濾，800 g 室溫離心5 min，棄上清，生理鹽水重懸，逐滴滴加于傾斜的66%percoll 溶液，按照升速為9，降速為1，1 000 g 離心30 min，離心完成后可看到離心管液體明顯分層，NEU 位于離心管底部，將離心管上層液體小心吸出丟棄，將細(xì)胞沉淀重懸，加入生理鹽水800 g 離心5 min，棄上清，除去殘存percoll溶液，細(xì)胞沉淀中加入適量上樣緩沖液裂解細(xì)胞，煮樣，-20℃存儲(chǔ)備用。

1.2.5.3 腹腔原位巨噬細(xì)胞（peritoneal macrophage，PM）分離 選取8～10 周齡WT 和MKO 小鼠，吸取適量提前預(yù)冷的1640 培養(yǎng)基（含5 mmol/L EDTA）注入小鼠腹腔，輕揉小鼠腹部，用5 ml 注射器將小鼠腹腔中的液體吸出，置于離心管，4℃、800 g離心5 min，棄上清，用適量的1640 培養(yǎng)基（不含血清）重懸細(xì)胞沉淀，接種至6 孔板，置于細(xì)胞孵化箱靜置2 h 后倒掉舊培養(yǎng)基并更換為1640+雙抗+10%血清培養(yǎng)過(guò)夜，觀察細(xì)胞形態(tài)，胰酶消化，培養(yǎng)基停止消化，離心，棄上清，加入適量上樣緩沖液，煮樣，-20℃存儲(chǔ)備用。

1.2.5.4 胸腺T 細(xì)胞分離 選取8～10 周齡WT 和MKO 小鼠，取出胸腺并于預(yù)冷的生理鹽水中剪碎研磨，細(xì)胞篩過(guò)濾，離心，棄上清，重懸計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)完成后加入上樣緩沖液并煮樣，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 Western blot 將制備完成的BMDMs、NEU、PM、胸腺T 細(xì)胞蛋白樣本進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，置于封閉液稀釋的ABRO1（1∶1 000）及內(nèi)參GAPDH（1∶20 000）抗體中4℃旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜，洗膜除去殘留的一抗，置于封閉液稀釋的HRP Goat Anti-Rabbit IgG二抗（1∶5 000）室溫孵育1～1.5 h，洗膜除去殘留的二抗，暗室顯影。

到了許都之后，曹操對(duì)關(guān)羽三日一小宴，五日一大宴，還送給他許多金銀財(cái)寶和美女。關(guān)羽就讓美女去服侍嫂嫂，又把財(cái)物都交給她們。后來(lái)，曹操又把呂布的赤兔馬送給關(guān)羽，關(guān)羽收下了，并再三拜謝。曹操十分奇怪，便問(wèn)關(guān)羽為何以前的賞賜從不感激，今天卻要再三拜謝呢？關(guān)羽答道，因?yàn)橛辛诉@匹赤兔千里馬，一旦得知?jiǎng)涞南侣洌涂梢栽缫稽c(diǎn)到他身邊了。曹操一聽，心中越發(fā)敬重關(guān)羽的為人。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠造血分化 取小鼠外周血和骨髓細(xì)胞，800 g 離心5 min，棄上清，加入3 ml Red Cell Lysis Buffer 固定裂紅10 min，加入3 ml PBS 終止裂紅，800 g 離心5 min，棄上清，加入200μl PBS 吹打混勻并分成兩份，一份加入CD45-PE、CD11b-efluor450、Ly6C-PE-Cy7、Ly6G-APC 流式抗體，一份加入CD45-PE、CD11b-efluor450、B220-APC、CD3-FITC 流式抗體，4℃避光孵育30 min，800 g 離心5 min，加入500 μl PBS 重懸作為檢測(cè)樣本，BD LSR Fortessa流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.8 LPS 誘導(dǎo)敗血癥 選取3 對(duì)適齡WT 小鼠和MKO 小鼠，每只小鼠腹腔注射10 mg/kg LPS，3 h 后眼球取血500μl，靜置30 min，3 000 r/min離心20 min，吸取上清，檢測(cè)相關(guān)生化指標(biāo)和炎癥因子水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用非配對(duì)雙尾t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Abro1flox/flox/Lyz2-Cre+小鼠獲得及鑒定

2.1.1Abro1flox/flox小鼠獲得及鑒定 采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將Abro1flox/+小鼠LoxP位點(diǎn)放置于Abro1基因2 號(hào)外顯子（exon2）區(qū)域兩側(cè)，構(gòu)建策略如圖1A。Abro1flox/flox基因型小鼠由Abro1flox/+基因型小鼠雄雌自交獲得，僅擴(kuò)增出338 bp 條帶的小鼠基因型為Abro1flox/flox純合子，僅擴(kuò)增出284 bp 條帶的小鼠基因型為Abro1+/+純合子，同時(shí)擴(kuò)增出338 bp和284 bp條帶的小鼠基因型為Abro1flox/+雜合子（圖1B）。結(jié)果表明Abro1flox/flox小鼠構(gòu)建成功。

圖1 Abro1flox/flox小鼠獲得及鑒定Fig.1 Obtainment and identification of Abro1flox/flox mice

2.1.2Abro1flox/flox/Lyz2-Cre+小鼠獲得及鑒定 為獲得Abro1flox/flox/Lyz2-Cre+基因型小鼠，首先將Abro1flox/flox與Lyz2-Cre+小鼠交配獲得Abro1flox/+/Lyz2-Cre+小鼠，再將其與Abro1flox/flox交配，最終獲得Abro1flox/flox/Lyz2-Cre+基因型小鼠。PCR 鑒定結(jié)果顯示，采用flox引物鑒定時(shí)僅擴(kuò)增出338 bp 條帶的小鼠基因型為Abro1flox/flox純合子，采用Lyz2-Cre 引物鑒定時(shí)可擴(kuò)增出721 bp 的小鼠基因型為L(zhǎng)yz2-Cre+，無(wú)條帶的小鼠基因型為L(zhǎng)yz2-Cre-（圖2A）。Abro1flox/flox/Lyz2-Cre+小鼠即為ABRO1 MKO 小鼠，Abro1flox/flox/Lyz2-Cre-小鼠在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中作為WT小鼠。

圖2 髓系特異性Abro1基因敲除小鼠獲得及鑒定Fig.2 Obtainment and identification of myeloid-specific Abro1 knockout mice

2.2 ABRO1 MKO 小鼠骨髓和外周血髓系細(xì)胞分化正常 由于ABRO1 MKO 小鼠在髓系細(xì)胞中特異性敲除ABRO1，因此探究其是否影響髓系細(xì)胞分化能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)WT和MKO小鼠骨髓和外周血中髓系細(xì)胞（CD11b+、CD11b+Ly6G+、CD11b+Ly6C+）和淋巴細(xì)胞（CD3+、B220+）組成，結(jié)果顯示，WT 和MKO 小鼠骨髓和外周血中髓系細(xì)胞（CD11b+、CD11b+Ly6G+、CD11b+Ly6C+）和淋巴 細(xì)胞（CD3+、B220+）組成無(wú)差異（圖3）。表明ABRO1 MKO 小鼠骨髓和外周血髓系細(xì)胞分化正常。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ABRO1 MKO 小鼠骨髓和外周血造血分化Fig.3 Hematopoietic differentiation of bone marrow and peripheral blood in ABRO1 MKO mice detected by flow cytometry

2.3 ABRO1 MKO 小鼠抵抗LPS 誘導(dǎo)的敗血癥為闡明ABRO1 在LPS 誘導(dǎo)的敗血癥的具體分子機(jī)制，構(gòu)建ABRO1 MKO 小鼠。LPS 誘導(dǎo)敗血癥實(shí)驗(yàn)生化指標(biāo)結(jié)果顯示，ABRO1 MKO 小鼠體內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT，又稱ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT，又稱AST）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、尿素水平均低于WT 小鼠（圖4A），表明ABRO1 MKO小鼠相比于WT小鼠損傷程度較低。血清中炎癥因子檢測(cè)結(jié)果顯示，ABRO1 MKO 小鼠炎癥因子IL-1β和IL-6分泌相比于WT小鼠顯著減少（圖4B）。LPS誘導(dǎo)的炎癥因子風(fēng)暴是導(dǎo)致小鼠損傷的主要原因。表明ABRO1 MKO 通過(guò)抑制小鼠炎癥因子分泌進(jìn)而抵抗LPS誘導(dǎo)的敗血癥。

圖4 ABRO1 MKO小鼠抵抗LPS誘導(dǎo)的敗血癥Fig.4 ABRO1 MKO mice resistant to LPS-induced sepsis

3 討論

常見基因功能的研究模式包括正向研究和反向研究，即體外過(guò)表達(dá)和體內(nèi)缺失［16］。基因編輯技術(shù)加速了基因功能探究，但研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)全基因敲除常導(dǎo)致小鼠胚胎死亡［17-18］。Cre/LoxP 系統(tǒng)不僅改善了小鼠胚胎致死導(dǎo)致的局限性，同時(shí)為在特定細(xì)胞亞群中研究基因功能提供了可能［14，18］。課題組前期研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，Abro1全基因敲除小鼠可顯著抵抗LPS 誘導(dǎo)的敗血癥以及MSU 導(dǎo)致的腹膜炎［12］。髓系特異性Abro1基因敲除小鼠的成功構(gòu)建，為進(jìn)一步揭示ABRO1 在免疫調(diào)節(jié)中的潛在機(jī)制提供了模型。

ZHENG 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，ABRO1 與SHMT 蛋白結(jié)合，介導(dǎo)BRISC 復(fù)合體去除IFNAR1 上K63 位鏈接的多聚泛素鏈，進(jìn)而啟動(dòng)干擾素信號(hào)通路，Abro1全基因敲除小鼠由于干擾素信號(hào)通路抑制進(jìn)而抵抗LPS 誘導(dǎo)的敗血癥。但課題組研究發(fā)現(xiàn)，LPS 等啟動(dòng)信號(hào)促進(jìn)ABRO1 與NLRP3 結(jié)合，這種結(jié)合依賴于NLRP3 蛋白第194 位絲氨酸（Ser194）磷酸化修飾。ABRO1 募集BRCC3 等組裝形成BRISC 復(fù)合體。在ATP 等激活信號(hào)作用下，BRISC 復(fù)合體去除NLRP3 上K63 位鏈接的多聚泛素鏈，激活NLRP3 炎癥小體，促進(jìn)IL-1β 成熟與分泌，啟動(dòng)天然免疫調(diào)控［12］。課題組認(rèn)為Abro1全基因敲除小鼠是由于NLRP3炎癥小體活化抑制進(jìn)而抵抗LPS誘導(dǎo)的敗血癥。NLRP3 炎癥小體是天然免疫的關(guān)鍵識(shí)別器，主要表達(dá)于髓系細(xì)胞［19-20］。但I(xiàn)FNAR1 不僅在髓系細(xì)胞中表達(dá)，在T 細(xì)胞、B 細(xì)胞以及非免疫細(xì)胞如MEF等均呈高表達(dá)。提示髓系中特異性敲除ABRO1 可顯著抑制NLRP3 信號(hào)通路活化，但對(duì)干擾素通路影響甚微［7，21］。本研究發(fā)現(xiàn)，ABRO1 MKO 小鼠通過(guò)減少IL-1β 分泌進(jìn)而抵抗LPS 誘導(dǎo)的敗血癥，表明Abro1全基因敲除小鼠主要通過(guò)髓系細(xì)胞中NLRP3炎癥小體活化抑制進(jìn)而抵抗LPS誘導(dǎo)的敗血癥。

DONAGHY 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，BRISC 復(fù)合體通過(guò)去除JAK2（janus kinase 2）蛋白上K63位鏈接的多聚泛素鏈，進(jìn)而影響造血干細(xì)胞群穩(wěn)態(tài)。Abro1全基因敲除小鼠中，HSC 增值和分化能力明顯增強(qiáng)，外周血中白細(xì)胞數(shù)一定程度提高。但本研究發(fā)現(xiàn)，ABRO1 MKO 小鼠骨髓和外周血髓系細(xì)胞分化正常，可能機(jī)制為髓系細(xì)胞中特異性敲除ABRO1并不會(huì)影響造血干細(xì)胞中ABRO1 表達(dá)，但ABRO1 MKO小鼠造血干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)是否受影響仍需進(jìn)一步探究。

本研究采用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)和Cre/LoxP 重組系統(tǒng)成功構(gòu)建髓系特異性Abro1基因敲除小鼠，為揭示ABRO1在髓系細(xì)胞中的功能提供了模型［15，23-24］。目前，關(guān)于ABRO1 的功能研究主要集中于免疫調(diào)控，在非免疫細(xì)胞中的潛在作用尚不明確。Abro1全基因敲除小鼠和髓系特異性敲除小鼠聯(lián)合使用也為揭示非免疫細(xì)胞中ABRO1 功能打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。