miR-103a-3p靶向PTEN基因促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及侵襲

陳 君 李 娜 葉 筠 王默然 朱寒玨（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院，武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心整形頜面外科，武漢 430000）

血管瘤是一種發(fā)生在皮膚血管上的良性腫瘤，多見(jiàn)于嬰幼兒時(shí)期。目前，血管瘤的發(fā)病機(jī)制尚不明確，通常認(rèn)為與血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（hemangioma endothelial cells，HemEC）的過(guò)度增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)［2］。因此，探究HemEC 增殖、遷移和侵襲的機(jī)制可為血管瘤的治療提供新靶點(diǎn)。微RNA（microRNA，miRNAs）是長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA，其可與靶基因的3'-UTR 結(jié)合，抑制靶mRNA 翻譯或降解靶mRNA，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程，在人類多種疾病尤其是腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用［3-5］。研究顯示，miR-103a-3p 在口腔鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中表達(dá)升高，作為促癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［6-7］。但目前miR-103a-3p 在血管瘤中的表達(dá)及其對(duì)血管瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響和分子機(jī)制還未知。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，miR-103a-3p 與第10 號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN）的3'-UTR 存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)，提示PTEN可能是miR-103a-3p的靶基因。研究顯示，PTEN 在血管瘤中表達(dá)降低，靶向上調(diào)其表達(dá)可抑制血管瘤細(xì)胞增殖和集落形成，并阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程［8］。本研究以HemEC 為研究對(duì)象，旨在探究miR-103a-3p 對(duì)HemEC 增殖、遷移和侵襲的影響及其能否靶向調(diào)控PTEN 發(fā)揮作用，以期為血管瘤的靶向分子治療提供新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 選取華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院2017 年5 月至2019 年3 月收治的23例血管瘤患兒的瘤組織和瘤旁正常皮膚組織，其中男14 例，女9 例，年齡2～15 個(gè)月，平均年齡（7.26±4.16）個(gè)月。所有瘤組織標(biāo)本經(jīng)病理診斷確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：患兒初次確診；術(shù)前未進(jìn)行任何治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤；接受激光、藥物注射等治療。本研究經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，患兒家屬自愿簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞與試劑 HemEC、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保存中心（ATCC）；細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青公司；噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；LipofectamineTM2000 購(gòu)自北京宜科思源科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司；遷移實(shí)驗(yàn)（Transwell）小室購(gòu)自美國(guó)Corning 公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購(gòu)自德國(guó)羅氏公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；兔抗人PTEN和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HemEC 和HUVEC 細(xì)胞復(fù)蘇后，均用含15% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1～2 d更換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%左右時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶消化，按照1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HemEC 以1×105個(gè)/孔接種于6 孔板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)60%左右時(shí)，更換為不含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)基。將HemEC 隨機(jī)分為anti-miR-130b-3p 組（轉(zhuǎn)染miR-130b-3p 抑制劑）、anti-miR-NC組（轉(zhuǎn)染抑制劑陰性序列）、pcDNA 組（轉(zhuǎn)染空載體）、pcDNA-PTEN 組（轉(zhuǎn)染PTEN 過(guò)表達(dá)載體）、antimiR-130b-3p+si-con 組（共轉(zhuǎn)染anti-miR-130b-3p 抑制劑和小干擾RNA 陰性序列）和anti-miR-130b-3p+si-PTEN組（共轉(zhuǎn)染anti-miR-130b-3p抑制劑和PTEN小干擾RNA），具體轉(zhuǎn)染操作參照LipofectamineTM2000 試劑盒，轉(zhuǎn)染時(shí)間為6 h。然后更換為含15%FBS 的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h 后，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-qPCR 檢測(cè)組織細(xì)胞中miR-103a-3p 和PTEN mRNA 表達(dá) RNA 抽提試劑盒提取組織或細(xì)胞中總RNA，微量核酸儀檢測(cè)RNA的純度和濃度后，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其合成為cDNA。然后以cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件：95℃5 min，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共35 個(gè)循環(huán)。miR-103a-3p 正向引物：5′-AATTCAAAAAAGCAGCATTGTACAGGGCTATGA-3′，反向引物：5′-CCGGTCATAGCCCTGTACAATGCTGCTTTTTTG-3′；PTEN正向引物：5′-CAATGACAGCCATCATCAAAGAG-3′，反向引物：5′-GCTCAGACTTTTGTAATTTGTG-3′；GAPDH 正向引物：5′-TCCCTCAAGATTGCTAGCAA-3′，反向引物：5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′；U6 正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-103a-3p 以U6 為內(nèi)參，PTEN 以GAPDH 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-103a-3p和PTEN mRNA的相對(duì)表達(dá)。

1.2.4 MTT 檢測(cè)細(xì)胞活力 轉(zhuǎn)染后的各組HemEC細(xì)胞以4×104個(gè)/孔接種于96 孔板，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h 和72 h 后，加入20μl MTT 溶液（5 g/L）。繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基，加入150μl二甲基亞砜，振蕩混勻后，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞光密度值（OD）。

1.2.5 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 轉(zhuǎn)染后的各組HemEC 細(xì)胞用不含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)基調(diào)整濃度為1×105個(gè)/ml 細(xì)胞懸液。遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell 小室置于24 孔板中，上室加入200 μl 細(xì)胞懸液，下室加入600μl 的15%FBS 培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，吸棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定30 min，0.4%結(jié)晶紫染色15 min。顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5 個(gè)視野，拍照并對(duì)遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：Matrigel 基質(zhì)膠4℃融化后，用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基以1∶8比例進(jìn)行稀釋。然后鋪于Transwell上室，自然干燥后，加入200μl細(xì)胞懸液，后續(xù)操作與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.6 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中PTEN 蛋白水平 轉(zhuǎn)染后的各組HemEC 細(xì)胞以2.5×105個(gè)/孔接種于24 孔板，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。RIPA 試劑提取細(xì)胞中總蛋白，BCA 蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白含量。取適量蛋白溶液，加入1×上樣緩沖液，混合均勻，100℃煮沸5 min。蛋白變性后，行10% SDSPAGE 電泳。電泳結(jié)束后，將分離蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1.5 h。加入PTEN 抗體（1∶1 000），4℃過(guò)夜孵育。加入山羊抗兔二抗（1∶2 000），37℃孵育2 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影后，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn) PCR 技術(shù)擴(kuò)增含miR-103a-3p 結(jié)合位點(diǎn)的PTEN-3'UTR 序列，克隆至psiCHECK2 雙熒光素酶報(bào)告載體，構(gòu)建PTEN 野生型（WT-PTEN）質(zhì)粒。同時(shí)利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)突變后，克隆至psiCHECK2 雙熒光素酶報(bào)告載體，構(gòu)建PTEN 突變型（MUT-PTEN）質(zhì)粒。HemEC 以1×105個(gè)/孔接種于6 孔板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)60%時(shí)，參照LipofectamineTM2000 試劑盒操作說(shuō)明書，分別將WT-PTEN 與miR-NC 或miR-103a-3p mimics、MUT-PTEN 與miR-NC 或miR-103a-3p mimics 共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)染操作同1.2.2。轉(zhuǎn)染6 h后，更換為含15%FBS 的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞，參照熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組的熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-103a-3p、PTEN在血管瘤組織中的表達(dá)如圖1 所示，與正常皮膚組織比較，血管瘤組織中miR-103a-3p 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），PTEN 的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。

圖1 miR-103a-3p和PTEN在血管瘤組織中的表達(dá)Fig.1 Expressions of miR-103a-3p and PTEN in hemangiomas tissue

2.2 miR-103a-3p、PTEN 在HemEC 和HUVEC 中的表達(dá) 如圖2 所示，與HUVEC 細(xì)胞比較，HemEC 細(xì)胞中miR-103a-3p 表達(dá)顯著升高（P＜0.05），PTEN 的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。

圖2 miR-103a-3p和PTEN在HemEC和HUVEC中的表達(dá)Fig.2 Expressions of miR-103a-3p and PTEN in HemEC and HUVEC

2.3 抑制miR-103a-3p 表達(dá)對(duì)HemEC 增殖的影響如圖3 所示，anti-miR-103a-3p 組HemEC 中miR-103a-3p 表達(dá)水平顯著低于anti-miR-NC 組（P＜0.05），表明anti-miR-103a-3p 轉(zhuǎn)染成功，細(xì)胞中miR-103a-3p 表達(dá)受到抑制。與anti-miR-NC 組比較，anti-miR-103a-3p 組HemEC 在48 h、72 h 時(shí)細(xì)胞OD值均顯著降低（P＜0.05）。

圖3 抑制miR-103a-3p表達(dá)對(duì)HemEC增殖的影響Fig.3 Effects of inhibiting miR-103a-3p on HemEC prolife-ration

2.4 抑制miR-103a-3p 表達(dá)對(duì)HemEC 遷移和侵襲的影響 如圖4 所示，與anti-miR-NC 組比較，antimiR-103a-3p 組HemEC 的遷移和侵襲數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。

圖4 抑制miR-103a-3p表達(dá)對(duì)HemEC遷移和侵襲的影響Fig.4 Effects of inhibiting miR-103a-3p on HemEC migra

2.5 過(guò)表達(dá)PTEN 對(duì)HemEC 增殖、遷移和侵襲的影響 如圖5所示，pcDNA-PTEN組HemEC中PTEN蛋白表達(dá)顯著高于pcDNA 組（P＜0.05），表 明pcDNA-PTEN 轉(zhuǎn)染成功，細(xì)胞中PTEN 過(guò)表達(dá)。與pcDNA 組比較，pcDNA-PTEN 組HemEC 在48 h、72 h時(shí)細(xì)胞OD 值顯著降低（P＜0.05），遷移和侵襲數(shù)顯著降低（P＜0.05）。

圖5 過(guò)表達(dá)PTEN對(duì)HemEC增殖、遷移和侵襲的影響Fig.5 Effects of over-expressing PTEN on HemEC proliferation，migration and invasion

2.6 miR-103a-3p靶向調(diào)控PTEN的表達(dá) miRcode在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站顯示，miR-103a-3p與PTEN3'UTR存在互補(bǔ)的核苷酸序列（圖6A）。miR-103a-3p 可降低WT-PTEN 的熒光素酶活性（P＜0.05），而對(duì)MUTPTEN 的熒光素酶活性無(wú)顯著影響（P＞0.05，圖6B）。miR-103a-3p 組PTEN 蛋白水平低于miR-NC 組（P＜0.05），anti-miR-103a-3p組PTEN 蛋白水平高于antimiR-NC組（P＜0.05，圖6C、D）。

圖6 miR-103a-3p靶向PTENFig.6 miR-103a-3p targets PTEN

2.7 敲減PTEN 表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制miR-103a-3p 對(duì)HemEC 增殖、遷移和侵襲的影響 如圖7 所示，與anti-miR-103a-3p+si-NC 組比較，anti-miR-103a-3p+si-PTEN 組HemEC 在48 h 和72 h 時(shí)的OD 值顯著升高（P＜0.05），遷移和侵襲數(shù)均顯著升高（P＜0.05）。

圖7 敲減PTEN 逆轉(zhuǎn)抑制miR-103a-3p對(duì)HemEC 增殖、遷移和侵襲的影響Fig.7 Knockdown of PTEN reversed effect of miR-103a-3p on HemEC proliferation，migration and invasion

3 討論

血管瘤是嬰幼兒時(shí)期常見(jiàn)的腫瘤之一,部分血管瘤無(wú)需進(jìn)行治療可自行消退，另有少部分血管瘤呈現(xiàn)持續(xù)性增長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)毀容及局部組織器官功能障礙［9-10］。研究表明，miRNAs 在血管瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，探究影響血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的miRNAs 及其作用機(jī)制，可為血管瘤的治療提供新靶點(diǎn)［11-13］。miR-103a-3p 是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如HU 等［14］研究顯示，miR-103a-3p 在胃癌組織中表達(dá)升高，抑制其表達(dá)通過(guò)負(fù)調(diào)控ATF7抑制胃癌細(xì)胞增殖，并阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，在胃癌中作為促癌基因發(fā)揮作用；SUN等［15］研究顯示，miR-103a-3p 在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，而且miR-103a-3p 表達(dá)與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，上調(diào)miR-103a-3p 可促進(jìn)缺氧條件下結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、血管生成和糖酵解；ZHANG 等［16］研究顯示，miR-103a-3p在甲狀腺癌組織中和細(xì)胞系中的表達(dá)增加，通過(guò)靶向抑制LATS1 的表達(dá)促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡，miR-103a-3p/LATS1 軸為甲狀腺癌治療提供了新靶點(diǎn)。但目前，miR-103a-3p在血管瘤中的表達(dá)及對(duì)血管瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響和分子機(jī)制尚未可知。

本研究顯示，miR-103a-3p 在血管瘤組織和HemEC 中均呈高表達(dá)，抑制其表達(dá)可降低HemEC的增殖、遷移和侵襲，提示miR-103a-3p 作為促癌基因參與血管瘤發(fā)生發(fā)展，其可作為血管瘤的分子治療靶點(diǎn)。本研究利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了miR-103a-3p 與PTEN 的靶向關(guān)系，并檢測(cè)了miR-103a-3p對(duì)HemEC中PTEN蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，PTEN 是miR-103a-3p 的靶基因，且miR-103a-3p負(fù)調(diào)控PTEN。

PTEN 是具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶活性的抑癌基因，可調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等影響腫瘤血管的生成，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［17］。研究顯示，PTEN 的過(guò)表達(dá)可通過(guò)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡［18］；miR-4310 通過(guò)靶向抑制PTEN 并激活PI3K/AKT 途徑促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)展［19］；miR-301a-3p在食管癌中表達(dá)升高，其靶向抑制PTEN 蛋白表達(dá)促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖力［20］。王川等［21］研究顯示，嬰幼兒血管瘤組織和細(xì)胞中PTEN 表達(dá)顯著降低，過(guò)表達(dá)PTEN 可通過(guò)下調(diào)VEGF、抑制VEGFR-2 的磷酸化來(lái)降低HemEC 的增殖能力，并促進(jìn)HemEC 凋亡。LI 等［22］發(fā)現(xiàn)，普萘洛爾可通過(guò)靶向miR-382 上調(diào)血管瘤細(xì)胞中PTEN 表達(dá)、抑制AKT/mTOR 信號(hào)通路來(lái)降低血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果與本研究過(guò)表達(dá)PTEN 可抑制HemEC 增殖、遷移和侵襲的結(jié)果一致。本研究還顯示，敲減PTEN逆轉(zhuǎn)了抑制miR-103a-3p對(duì)HemEC增殖、遷移和侵襲的抑制作用，進(jìn)一步證明抑制miR-103a-3p可以通過(guò)上調(diào)PTEN抑制血管瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-103a-3p在血管瘤組織和血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中呈高表達(dá)，抑制miR-103a-3p 可降低血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與靶向負(fù)調(diào)控PTEN 有關(guān)，miR-103a-3p/PTEN 軸可能為血管瘤的靶向治療提供新靶點(diǎn)。