Ad-apoptin通過AMPK/ACC信號通路抑制肺癌細(xì)胞脂代謝①

宋高杰 尚 超 李一權(quán) 朱羿龍 金寧一 李 霄（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，延吉 133002）

肺癌是我國發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，數(shù)據(jù)顯示2020 年我國肺癌新發(fā)病例82 萬例，死亡病例71 萬例（http：//gco.iarc.fr）。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要組織類型，約占所有肺癌的80%［1］。在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞需要攝取及合成大量的脂類物質(zhì)以滿足其細(xì)胞生理活動及合成細(xì)胞膜主要組成成分［2］。研究表明腫瘤細(xì)胞普遍存在糖脂代謝紊亂現(xiàn)象，即Warburg 效應(yīng)，表現(xiàn)為攝入葡萄糖量增高、糖酵解活性增強和乳酸堆積。脂代謝異常在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和其他腫瘤中被廣泛研究［3-5］。最近研究發(fā)現(xiàn)通過降低肺癌ACSS2 介導(dǎo)的乙酰輔酶A活性和組蛋白H4乙?；种浦|(zhì)合成，從而抑制肺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的新機制［6］。因此，降低腫瘤細(xì)胞脂代謝為治療肺癌提供了新的研究思路。

凋亡素（apoptin）是雞貧血病毒VP3 基因的產(chǎn)物，是一種長13.6 kD 的小蛋白，具有選擇性殺傷多種人類腫瘤或轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力，對正常細(xì)胞沒有毒性作用［7］。在先前的研究中，本課題組構(gòu)建了表達(dá)Apoptin的重組人5型腺病毒，并將其命名為Ad-VP3（Ad-apoptin），已被證明可在腫瘤細(xì)胞中有效的表達(dá)Apoptin［8］。AMPK 是細(xì)胞能量感應(yīng)和恢復(fù)代謝平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[9]。而ACC 是AMPK 的底物，為脂肪酸的生物合成提供丙二酰輔酶A 底物，丙二酰輔酶A 被磷酸化關(guān)閉，被去磷酸化激活[10]。本研究中，首次發(fā)現(xiàn)AMP 激活的蛋白激酶（AMPK）-乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）信號通路與Ad-apoptin 誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。從機制上講，Ad-apoptin 激活肺癌細(xì)胞中的AMPK，進(jìn)而觸發(fā)凋亡和ACC 抑制。抑制ACC 有助于Ad-apoptin 降低細(xì)胞脂代謝，從而增強細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果表明，Ad-apoptin 通過AMPK/ACC 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)脂代謝來促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡，為研究脂代謝重編程與細(xì)胞凋亡之間的相互作用提供了新的見解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、病毒和動物 A549 和NCI-H23 細(xì)胞系購自上海生物科學(xué)研究所細(xì)胞庫。重組溶瘤腺病毒（Ad-mock 和Ad-apoptin）由實驗室（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院長春獸醫(yī)研究所）構(gòu)建并保存。雌性BALB/c裸鼠購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，所有動物實驗方案均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院長春獸醫(yī)研究所動物護(hù)理與使用委員會（IACUC）批準(zhǔn)。所有手術(shù)均在戊巴比妥鈉麻醉下進(jìn)行，符合標(biāo)準(zhǔn)實驗動物操作程序。

1.1.2 主要試劑 CCK-8 試劑盒（日本同仁化學(xué)，貨號：CK04）；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I（BD 生物科技，貨號：556547）；riboFECT CP（Ribobio，貨號：C10511-05）；PAGE凝膠快速制備試劑盒（10%）（上海雅酶生物科技，貨號：PG112）；MinuteTM總蛋白提取試劑盒（Invent Biotechnologies，貨號：SD001/SN002）；Fatty Acid and Lipid Metabolism Antibody Sampler Kit（CST，貨號：8335T）；改良油紅O染色試劑盒（碧云天，貨號：C0158S）；三酰甘油（triglyceride，TG）和總膽固醇（total cholesterol，TC）（南京建成，貨號：A111-1-1 和A110-1-1）；PARP（CST，貨號：9532s）；TOFA（MCE，貨號：HY-101068）；AMPK（CST，貨號：5831）；Apoptin（Abcam，貨號：ab193612）。

1.1.3 主要儀器 SUNRISE 多功能酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan 公司；蛋白印跡電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和顯影儀購自美國Bio-Rad 公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司；Accuri C6 Plus 流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)期NSCLC A549 和NCIH23細(xì)胞，以5×105個/孔接種于6孔板。當(dāng)達(dá)到60%融合時，根據(jù)riboFECT CP 說明書分別將si-NC 和si-AMPK 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細(xì)胞用于后續(xù)測定。

1.2.2 Western blot 用MinuteTM總蛋白提取試劑盒從肺癌細(xì)胞（A549 和NCI-H23）中提取總蛋白后用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白30μg 通過10%SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜（0.45 μm）上。用5%BSA 快速封閉液封閉20 min，加入PARP、FASN、Lipin1、ACSL1、AceCS1、p-ACL等兔來源的單克隆一抗（1∶1 000 稀釋）4℃孵育過夜，TBST 清洗4 次，每次8 min，加入對應(yīng)山羊抗兔二抗（1∶3 000 稀釋）室溫孵育40 min，用TBST 清洗4 次，每次8 min，然后，滴加ECL顯色并曝光拍照。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 用預(yù)冷PBS 清洗收集的細(xì)胞，向細(xì)胞沉淀中加入1×Binding Buffer工作液并重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106個/ml。取200 μl 細(xì)胞懸液，離心后加入300 μl 含有5 μl Annexin V-FITC 和10μl PI的1×Binding Buffer，避光室溫孵育20 min后用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 油紅O染色 取處理后的細(xì)胞，加入染色洗滌液覆蓋細(xì)胞20 s，吸除染色洗滌液，加入適量油紅O 染色工作液，避光染色15 min 后用PBS 清洗2 次，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞脂質(zhì)積累情況。

1.2.5 TG和TC 含量測定 將A549 和NCI-H23 細(xì)胞以6×105個/孔的濃度分別接種到6 孔板中，在37℃、5%CO2下培養(yǎng)18 h，分別感染150 MOI Ad-mock和Ad-apoptin。按照說明檢測細(xì)胞TG和TC相對含量。

1.2.6 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP） 將含有蛋白酶抑制劑的預(yù)冷IP 細(xì)胞裂解液加入至收集的細(xì)胞中，4℃裂解30 min，離心后用BCA法測定蛋白濃度，取上清液變性后用于input。向?qū)φ眨–ontrol）組蛋白上清液中加入1.0 μg IgG 和20 μl Protein A/G 珠子，Ad-apoptin 組加入20 μl Protein A/G 珠子，4℃孵育1 h；離心后取上清，加入抗體后4℃孵育過夜；加入80 μl Protein A/G-珠子，4℃孵育2 h；離心后收集免疫沉淀復(fù)合物；將免疫沉淀復(fù)合物用1 ml 預(yù)冷的IP 裂解液（不含抑制劑）洗滌4 次，每次離心后吸去上清液，加入80μl 1×還原型上樣緩沖液，沸水煮10 min，離心取10μl 上清用于Western blot檢測。

1.2.7 動物實驗 在每只裸鼠右腿皮下接種NSCLC A549 細(xì)胞1×107個，接種7 d 后出現(xiàn)米粒大小質(zhì)硬結(jié)節(jié)即為NSCLC 荷瘤小鼠模型構(gòu)建成功，將建模成功小鼠隨機分為Control 組和Ad-apoptin 組。Ad-apoptin 組瘤內(nèi)給藥1×107PFU Ad-apoptin，Control 組瘤內(nèi)注射等體積生理鹽水，1 次/3 d，連續(xù)治療4 周。第30 天時，在戊巴比妥鈉麻醉下頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下腫瘤，免疫組化檢測Ki-67，TUNEL，p-AMPK和FASN陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)通過Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理分析，兩組比較采用Student's 法檢驗，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)以3個或更多獨立樣本的表示。

2 結(jié)果

2.1 Ad-apoptin抑制肺癌細(xì)胞的活性 CCK-8結(jié)果顯示，Ad-apoptin呈劑量依賴性抑制細(xì)胞增殖（圖1），而空載體Ad-mock 對肺癌細(xì)胞無顯著抑制作用。Ad-apoptin 在A549 和NCI-H23 細(xì)胞中處理24 h 的IC50約為150 MOI（圖1），該劑量用于后續(xù)實驗。

圖1 Ad-apoptin抑制肺癌細(xì)胞的活性Fig.1 Ad-apoptin inhibits cell viability of lung cancer cells

2.2 Ad-apoptin 誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡 為了研究Adapoptin 對肺癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡作用機制，采用JC-1染色法檢測了Ad-apoptin 作用于A549 和NCI-H23細(xì)胞后細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果表明，Control 組和Ad-mock組中的大多數(shù)細(xì)胞呈紅色，而在Ad-apoptin處理組（圖2A）中可觀察到紅色熒光的消失及綠色熒光的增加，表明Ad-apoptin 具有誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的能力，而線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。Annexin V-FITC/PI結(jié)果顯示，Ad-apoptin 使A549 和NCI-H23 細(xì)胞的凋亡率分別增加了27.4%和33.2%（圖2B）。此外，經(jīng)Adapoptin 處理的這兩種細(xì)胞系中，裂解的PARP 的水平升高（圖2C）。以上數(shù)據(jù)表明Ad-apoptin能有效誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。

圖2 Ad-apoptin誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡Fig.2 Ad-apoptin induces apoptosis of lung cancer cells

2.3 Ad-apoptin 通過抑制AMPK 依賴的ACC 抑制肺癌細(xì)胞的脂質(zhì)代謝 為了進(jìn)一步闡明Ad-apoptin對AMPK 信號的作用，通過Western blot 檢測Adapoptin 處理前后肺癌細(xì)胞脂肪酸合成代謝相關(guān)分子的變化。經(jīng)Ad-apoptin 處理的A549 和NCI-H23細(xì)胞中ACC 的磷酸化水平顯著增加，而FASN、Lipin1、ACSL1、AceCS1和p-ACL蛋白表達(dá)顯著降低，這表明Ad-apoptin可能通過抑制ACC 活性來下調(diào)脂肪生成（圖3A）。為了驗證這一點，用油紅O 染料對A549 和NCI-H23 細(xì)胞脂質(zhì)進(jìn)行染色。如圖3B 所示，在沒有Ad-apoptin 處理的情況下，可觀察到大量脂質(zhì)累積。相反，經(jīng)Ad-apoptin 處理后的細(xì)胞中脂質(zhì)積累明顯減少（圖3B）。與Control 組比較，Adapoptin 的TG（圖3C）和TC（圖3D）的相對含量顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明Ad-apoptin 主要是通過AMPK抑制ACC進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的脂質(zhì)代謝。

圖3 Ad-apoptin 通過抑制AMPK 依賴的ACC 抑制肺癌細(xì)胞的脂質(zhì)代謝Fig.3 Ad-apoptin suppresses lipid metabolism of lung cancer cells by AMPK-dependent ACC inhibition

2.4 AMPK/ACC 信號通路參與Ad-apoptin 誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡 本課題組研究了Ad-apoptin 在AMPK/ACC 信號通路中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要性。數(shù)據(jù)顯示，si-AMPK 減弱 了Ad-apoptin 誘導(dǎo)的p-ACC 的增加，這也顯著緩解了Ad-apoptin 誘導(dǎo)A549 和NCIH23細(xì)胞的凋亡（圖4A、C）。TOFA 可轉(zhuǎn)化為TOFyl-CoA，并對ACC 產(chǎn)生抑制作用。TOFA 與Ad-apoptin共同作用于A549和NCI-H23細(xì)胞后，與單獨處理相比，細(xì)胞凋亡增加，p-ACC 磷酸化增強（圖4B、D），這表明Ad-apoptin 促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡高度依賴于AMPK/ACC 信號。為了探討Apoptin 與AMPK 的關(guān)系，進(jìn)行了Co-IP 實驗。結(jié)果見圖4E，外源性Apoptin 被AMPK 沉淀，提示Apoptin 與AMPK 相互作用。

圖4 AMPK-ACC 信號通路參與Ad-apoptin 誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡Fig.4 AMPK-ACC signaling contributes to Ad-apoptininduced apoptosis of lung cancer cells

2.5 Ad-apoptin 對體內(nèi)腫瘤生長的抑制作用 在A549 裸鼠移植瘤中，Ad-apoptin 組腫瘤體積明顯低于Control 組（P＜0.01，圖5A）。在30 d 治療過程中，2 個實驗組中的裸鼠體質(zhì)量無顯著性差異，說明Ad-apoptin 沒有產(chǎn)生明顯的毒性（圖5B）。同時Ad-apoptin組生存率明顯高于Control組（圖5C）。免疫組化結(jié)果表明，與Control 組相比，Ad-apoptin 組Ki-67 蛋白表達(dá)量顯著下降，而TUNEL 蛋白表達(dá)量與之相反（圖5D，P＜0.01）。Ad-apoptin 組p-AMPK蛋白表達(dá)量高于Control 組，而FASN 的表達(dá)量低于Control組，與體外實驗結(jié)果一致（圖5E）。

圖5 Ad-apoptin對體內(nèi)腫瘤生長的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of apoptin on tumor growth in vivo

3 討論

肺癌是全世界惡性腫瘤相關(guān)發(fā)病率和病死率的主要原因［11］。為了降低病死率，必須尋找一種副作用少、療效顯著的治療方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，分子靶向治療成為人們關(guān)注的焦點。代謝重編程，包括Warburg 效應(yīng)（葡萄糖攝取增加、有氧糖酵解和乳酸產(chǎn)生）和脂質(zhì)代謝異常，在惡性腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移中起著重要作用［12-13］。因此，分析代謝異常，尋找“代謝靶點”已成為惡性腫瘤治療的新策略。

溶瘤腺病毒能選擇性感染殺傷腫瘤細(xì)胞，已成為抗腫瘤新藥的又一研究熱點［14］。本課題組早期研究發(fā)現(xiàn)Ad-apoptin 主要針對腫瘤細(xì)胞，對正常人體細(xì)胞無副作用，安全性高［7］。在以往的研究中，發(fā)現(xiàn)Ad-apoptin 通過內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，還可以影響腫瘤細(xì)胞的自噬和增加活性氧［7，15-16］。這些與腫瘤細(xì)胞的殺傷密切相關(guān)，然而溶瘤腺病毒對腫瘤脂代謝的機制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)Ad-apoptin 通過AMPK 的激活和細(xì)胞凋亡在肺癌細(xì)胞中顯示出很強的抗癌活性。Ad-apoptin 上調(diào)AMPK/ACC 信號通路降低脂質(zhì)代謝，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡。這一新的機制探索了抑制AMPK 依賴的ACC 在Ad-apoptin 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵作用，從另一層面揭示癌癥治療中脂代謝和細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系（圖4），與GAO 等［2］發(fā)現(xiàn)上調(diào)AMPK/ACC可降低胰腺癌脂代謝和誘導(dǎo)凋亡的研究結(jié)果一致。本次研究還發(fā)現(xiàn)Ad-apoptin 的治療在裸鼠移植瘤中也取得預(yù)期的效果。

脂代謝參與許多細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)，脂代謝紊亂在病理上與癌癥有關(guān)［17］。ACC 作為脂肪酸合成的限速酶，在癌細(xì)胞的生長和存活中起著關(guān)鍵作用［18］。AMPK 的磷酸化將ACC 轉(zhuǎn)化為非活性形式，導(dǎo)致脂代謝降低。在本研究中，探討了Ad-apoptin可能通過激活肺癌細(xì)胞中的AMPK信號來提高ACC磷酸化水平。本課題組還發(fā)現(xiàn)敲低AMPK 基因或ACC 的失活可以減弱Ad-apoptin 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提示AMPK/ACC 信號通路參與細(xì)胞凋亡。雖然肺癌細(xì)胞株和移植瘤裸鼠的研究結(jié)果足以證明AMPK-ACC 信號在Ad-apoptin 治療中的作用和重要性，但目前的研究沒有在臨床上得以證實，無法確定這一分子機制是否與Ad-apoptin 在臨床癌癥模型中的治療結(jié)果一致。

綜上所述，研究結(jié)果探索了Ad-apoptin 靶向AMPK，在AMPK/ACC 信號通路中參與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵作用，并為腫瘤脂代謝和細(xì)胞凋亡之間的相互作用提供了新的見解。