雙氫青蒿素通過抑制HMGB2 表達(dá)及逆轉(zhuǎn)EMT 進(jìn)程抑制肝癌細(xì)胞生長及侵襲①

楊晨雪 魏雁虹 魏海峰 米旭光 宋 帥 李 明 耿 輝 楊廣民（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130021）

原發(fā)性肝癌是臨床最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率逐年上升［1-2］。與其他惡性腫瘤細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲及遷移能力，因此具有起病隱匿、進(jìn)展迅速等特點［3］?；颊叱霈F(xiàn)癥狀就診時往往已處于晚期而錯過最佳手術(shù)時機(jī)，導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后和生存率均不理想。研究證實，高遷移率族蛋白2（high mobility group box 2，HMGB2）在肝癌細(xì)胞中表達(dá)增加，其高表達(dá)可促進(jìn)肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）細(xì)胞增殖，提高其侵襲能力［4］。新近研究表明，HMGB2 還可能是一種新型上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）介導(dǎo)物［5］。EMT 過程使腫瘤細(xì)胞獲得較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，與腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)［6］。逆轉(zhuǎn)這一過程是抗腫瘤新藥篩選的目標(biāo)之一。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）分子式為C15H24O5，分子量為284.35，為含過氧化基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯化合物，是1973年屠呦呦為鑒定青蒿素化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有羰基而創(chuàng)制的第一個青蒿素還原衍生物，隨著研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)其不僅具有抗瘧活性，還具有抗炎、抗腫瘤、抗肺纖維化等作用，甚至具有調(diào)節(jié)免疫抗腫瘤作用，在抗腫瘤復(fù)發(fā)方面亦顯示出較好的應(yīng)用前景，但對其抗腫瘤作用機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)研究［7］。本文通過體外實驗觀察DHA 對肝癌細(xì)胞生長及遷移、侵襲的抑制作用，并從DHA 對HMGB2 表達(dá)及EMT 進(jìn)程影響的角度分析其抗腫瘤作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源 人肝癌細(xì)胞株HepG2 由吉林省人民醫(yī)院中心實驗室提供；人肝癌細(xì)胞株LM3（WHELAB C1010）購自上海盈灣生物科技有限公司。

1.1.2 藥品與試劑 DHA 購自北京索萊寶科技有限公司；順鉑購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司；高糖培養(yǎng)基DMEM 購自德國BRAND 公司；胎牛血清（FBS）購自美國CLARK公司；青霉素-鏈霉素雙抗購自美國Gibco 公司；甲基噻唑藍(lán)（MTT）購自美國Sigma 公司；細(xì)胞凋亡試劑盒、RIPA 裂解液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell 小室購自Corning公司；一抗與二抗均購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2 和LM3 細(xì)胞均采用含10%FBS 及1%青霉素鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基于37℃、5%CO2孵育，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～100%融合時消化傳代，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 MTT 檢測細(xì)胞存活率 取對數(shù)增長期HepG2 細(xì)胞株制備細(xì)胞懸液，采用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度稀釋為10×105個/ml，接種于96孔板，100μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 至細(xì)胞完全貼壁，分別加入0、2.5、5、10、20、40μg/ml 順鉑溶液處理24 h、48 h、72 h，檢測不同濃度順鉑在不同時間對HepG2 細(xì)胞存活率的影響。按照同樣方法，采用0、20、40、80、160、320 mmol/L DHA 處理HepG2 細(xì)胞24 h、48 h、72 h，檢測不同濃度DHA 在不同時間對HepG2 細(xì)胞存活率的影響。同理，采用0、40、80、160、320、640μg/ml順鉑溶液處理LM3 細(xì)胞24 h、48 h、72 h，檢測不同濃度順鉑在不同時間對LM3 細(xì)胞存活率的影響，以及采用0、40、80、160、320、640 mmol/L DHA 處理LM3 細(xì)胞24 h、48 h、72 h，檢測不同濃度DHA 在不同時間對LM3 細(xì)胞存活率的影響。以上實驗每組均設(shè)5 個復(fù)孔，24 h 后加入MTT（20μl/孔），4 h 后棄培養(yǎng)基，100 μl/孔加入DMSO，振蕩混勻5 min 后酶標(biāo)自動分析儀測定490 nm處吸光度。

1.2.3 劃痕實驗 取對數(shù)生長期HepG2 細(xì)胞接種于6 孔板，24 h 后細(xì)胞融合度達(dá)100%時，用槍頭小側(cè)劃破細(xì)胞中軸，分別加入含2.5 μg/ml 順鉑和20 μmol/L DHA 的無血清DMEM 培養(yǎng)基，并設(shè)置陰性對照組。同理，用含40 μg/ml 順鉑和40 μmol/L DHA的無血清DMEM 培養(yǎng)基處理LM3細(xì)胞，并設(shè)置陰性對照組。以上實驗每組設(shè)2個重復(fù)。0 h、24 h、48 h、72 h時顯微鏡拍攝劃痕愈合程度。

1.2.4 侵襲實驗 采用含5%FBS的DMEM 培養(yǎng)基將HepG2細(xì)胞制成1×105個/ml細(xì)胞懸液，各Transwell小室上層加入100μl 細(xì)胞懸液，小室下室分別加入含2.5 μg/ml 順鉑、20 μmol/L DHA 的含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基500μl，并設(shè)立陰性對照。同理用含5%FBS的DMEM培養(yǎng)基將LM3細(xì)胞制成1×105個/ml細(xì)胞懸液，各Transwell 小室上層加入100μl 細(xì)胞懸液，小室下室加入含40 μg/ml 順鉑、40 μmol/L DHA的含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基500 μl，并設(shè)立陰性對照。培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行蘇木精、伊紅染色，顯微鏡拍照計數(shù)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞接種于6孔板，24 h后分別加入含10、20 μg/ml 順鉑、80、160 μmol/L DHA 的完全培養(yǎng)基，并設(shè)置陰性對照組。同理，采用含40、80μg/ml順鉑和80、160 μmol/L DHA 的完全培養(yǎng)基處理LM3 細(xì)胞，并設(shè)置陰性對照組。24 h 后PBS 洗滌2 次，采用不含EDTA 的胰酶消化，收集細(xì)胞，Annexin V/PI雙染色法通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 Western blot 取對數(shù)生長期HepG2 和LM3細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，并分為兩組，HepG2 細(xì)胞組采用2.5 μg/ml 順鉑處理以及20 μmol/L DHA 處理；LM3 細(xì)胞組采用40 μg/ml 順鉑處理以及40 μmol/L DHA 處理。48 h 后將上述細(xì)胞加入適量蛋白裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，進(jìn)行SDA-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉，分別加入Caspase-3、Cleavedcaspase3、Bax、Bcl-2、HMGB2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，第2天用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，顯影儀顯影，分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用表示，兩組間連續(xù)變量比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHA 對肝癌細(xì)胞存活率的影響 MTT 檢測結(jié)果顯示，隨著順鉑以及DHA 藥物濃度提高，與陰性對照組相比，順鉑組以及DHA 組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05，圖1A）。HepG2細(xì)胞在2.5μg/ml順鉑、20μmol/L DHA及LM3細(xì)胞在40μg/ml 順鉑、40μmol/L DHA 同一藥物濃度作用時，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，隨著時間增加細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05，圖1B）。

圖1 DHA對HepG2和LM3細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of DHA on survival rate of HepG2 and LM3 cells

2.2 DHA 對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響 與陰性對照組相比，順鉑及DHA 處理的兩組細(xì)胞24 h 時HepG2 細(xì)胞和LM3 細(xì)胞遷移率明顯降低，48 h、72 h時，兩組細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01，圖2）。

圖2 DHA對HepG2和LM3細(xì)胞遷移的影響Fig.2 Effects of DHA on migration of HepG2 and LM3 cells

2.3 DHA 對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，兩種肝癌細(xì)胞經(jīng)過順鉑以及DHA 處理后，侵入小室的腫瘤細(xì)胞數(shù)明顯少于陰性對照組（P＜0.001，圖3）。

圖3 DHA對HepG2和LM3細(xì)胞侵襲的影響Fig.3 Effects of DHA on invasion of HepG2 and LM3 cells

2.4 DHA 對肝癌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組（0.03%）相比，隨著順鉑和DHA藥物濃度增加，肝癌細(xì)胞凋亡率逐漸提高。80、160μmol/L DHA 作用于HepG2 細(xì)胞24 h 后，凋亡率分別為5.84%和81.26%（P＜0.05），80、160 μmol/L DHA 作用于LM3 細(xì)胞24 h 后，凋亡率分別為7.61%和24.70%（P＜0.05，圖4）。Western blot 結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，兩種肝癌細(xì)胞經(jīng)過順鉑和DHA作用48 h 后，Cleaved-caspase3、Bax 表達(dá)明顯增加，Bcl-2表達(dá)顯著降低（P＜0.05，圖5）。

圖4 DHA對HepG2和LM3細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effects of DHA on apoptosis of HepG2 and LM3 cells

圖5 DHA 對HepG2 和LM3 細(xì) 胞Caspase-3、Cleavedcaspase3、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of DHA on expressions of Caspase-3，Cleaved-caspase3，Bax and Bcl-2 proteins in HepG2 and LM3 cells

2.5 DHA 對HMGB2 以及EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，DHA 可顯著抑制肝癌細(xì)胞HMGB2 表達(dá)（P＜0.05），且在兩種肝癌細(xì)胞實驗中均發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，DHA 處理組、順鉑組E-cadherin表達(dá)增加，而N-cadherin、Vimentin 表達(dá)降低（P＜0.05，圖6）。

圖6 DHA 對HepG2 和LM3 細(xì) 胞HMGB2 及EMT 相 關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of DHA on expressions of HMGB2 and EMT related proteins in HepG2 and LM3 cells

3 討論

原發(fā)性肝癌治療過程中化療藥物有效率低、不良反應(yīng)大，導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后較差，遠(yuǎn)期療效不盡如人意。尤其是常用的鉑類化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，且不能特異性針對腫瘤細(xì)胞，對自身正常細(xì)胞有較大危害，因此急需探索一種對人體傷害較小的新型藥物［8］。DHA在多種腫瘤研究中被證實具有抗腫瘤作用或與其他化療藥物一起產(chǎn)生協(xié)同增效作用［9-10］。本研究通過體外實驗，采用不同濃度DHA 作用于HepG2 和LM3 兩種不同人肝癌細(xì)胞，24～72 h 后觀察DHA 對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHA 可顯著抑制肝癌細(xì)胞生長，且DHA 劑量越大、作用時間越長，肝癌細(xì)胞存活率越低，且呈時間-劑量依賴性。常規(guī)化療藥物順鉑在兩種不同肝癌細(xì)胞中顯示出不同抗腫瘤作用，對于高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌LM3細(xì)胞，需要更大劑量才能發(fā)揮殺傷作用（HepG2和LM3 細(xì)胞IC50分別為13.79 及336.12 μg/ml），這種選擇性抗腫瘤作用可以解釋為什么臨床使用相同含鉑化療方案但不同患者間療效不盡相同。腫瘤在個體間的異質(zhì)性決定部分肝癌患者可能需要更大的順鉑劑量才能達(dá)到治療效果，而在實際臨床應(yīng)用中，高劑量化療藥物同樣會帶來巨大副作用和不良反應(yīng)，一直是腫瘤治療的難點。而本研究發(fā)現(xiàn)，DHA 不僅與一定劑量的順鉑化療藥物具有相同功效的抗腫瘤作用，且對兩種不同類型肝癌細(xì)胞的生長抑制作用差異不大（HepG2 和LM3 細(xì)胞IC50分別為143.89 及242.12μmol/L），顯示出較好的臨床應(yīng)用前景。

為探究DHA 抑制肝癌細(xì)胞生長的原因，本研究通過流式細(xì)胞技術(shù)和Western blot 實驗發(fā)現(xiàn)，DHA可促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3、Bax 表達(dá)，Bcl-2 表達(dá)降低，且DHA 對HepG2 細(xì)胞凋亡的影響與劑量聯(lián)系密切，20μmol/L DHA 作用于HepG2 細(xì)胞24 h 時細(xì)胞凋亡率為5.09%，與對照組（0.03%）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），濃度為40 μmol/L 時細(xì)胞凋亡率為5.44%，80 μmol/L DHA 時細(xì)胞凋亡率為5.84%，而160 μmol/L 時細(xì)胞凋亡率則達(dá)到81.26%，說明DHA 對肝癌細(xì)胞凋亡的影響在一定濃度范圍內(nèi)作用區(qū)別不大，但DHA 在更高濃度后對肝癌細(xì)胞HepG2 的影響顯著提高，但對LM3 細(xì)胞卻無此趨勢，可能是腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性導(dǎo)致藥物作用效果不同。當(dāng)然，由于藥物吸收利用度的關(guān)系，體內(nèi)外實驗存在巨大差別，對于成藥可能性而言，160μmol/L有效藥物濃度過大，尚無法有力說明其有多顯著的抗腫瘤作用，有待后續(xù)通過動物實驗進(jìn)一步研究。

此外，本研究通過劃痕及侵襲實驗驗證了DHA對肝癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的影響，結(jié)果顯示，DHA 處理后肝癌細(xì)胞遷移及侵襲能力顯著降低，提示DHA可有效對抗肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。同時發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，DHA 處理組HMGB2 表達(dá)明顯降低，說明HMGB2 可能是DHA 抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的靶點。近年人們發(fā)現(xiàn)HMGB2 在胃癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和胰腺癌中高表達(dá)，是一種可在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移與侵襲中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞外信號分子［11］。LI 等［12］敲除胃癌細(xì)胞MALAT1 發(fā)現(xiàn)，HMGB2 表達(dá)顯著降低，細(xì)胞增殖及侵襲能力減弱；WU 等［13］通過對敲低HMGB2 的3 種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，3 種細(xì)胞遷移和侵襲能力均不同程度減弱，且侵襲相關(guān)標(biāo)志物p53、MMP2 和TIMP2 表達(dá)減少；CAI 等［14］構(gòu)建了抑制HMGB2 表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞系后發(fā)現(xiàn)，糖酵解相關(guān)蛋白GLUT1、HK2 和LDHA mRNA 表達(dá)相對陰性對照組明顯降低，說明HMGB2 可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞糖酵解和增殖。劉愛蕙等［15］通過靶向沉默乳腺癌細(xì)胞HMGB2 表達(dá)，實驗組較空白對照組侵襲癌細(xì)胞數(shù)明顯減少，提示HMGB2 與癌細(xì)胞增殖及侵襲相關(guān)。高遷移率族蛋白廣泛分布于真核生物的單核巨噬細(xì)胞核，屬于免疫性非組蛋白，既往研究表明其與過敏性紫癜、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫性疾病密切相關(guān)。HMGB2是一種炎癥誘導(dǎo)因子，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞炎癥因子持續(xù)產(chǎn)生形成慢性炎癥狀態(tài)，促進(jìn)免疫抑制微環(huán)境形成。DHA 具有免疫調(diào)節(jié)作用，可能通過調(diào)節(jié)HMGB2 表達(dá)干擾腫瘤免疫微環(huán)境，可能是DHA 與其他化療藥物協(xié)同增效作用的機(jī)制之一，值得深入研究。

EMT 是上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，在癌癥轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步探討DHA 抑制肝癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的機(jī)制，本研究觀察了DHA 對肝癌細(xì)胞EMT進(jìn)程的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHA處理后的肝癌細(xì)胞E-cadherin 表達(dá)顯著增加，N-cadherin、Vimentin 表達(dá)明顯減少，可有效逆轉(zhuǎn)肝癌EMT 進(jìn)程。且本研究發(fā)現(xiàn)順鉑對肝癌細(xì)胞EMT 進(jìn)程同樣具有一定抑制作用，類似的研究結(jié)果也有報道。如王績英等［16］發(fā)現(xiàn)肺癌A549細(xì)胞中順鉑單獨使用可抑制A549細(xì)胞增殖，減弱A549 細(xì)胞遷移侵襲運動能力，同時上調(diào)E-cadherin mRNA 及蛋白表達(dá)。錢亞云等［17］發(fā)現(xiàn)人肝癌細(xì)胞HepG2 中順鉑可抑制肝癌細(xì)胞增殖，縮短遷移距離，降低N-cadherin、Vimentin表達(dá)，同時增加E-cadherin蛋白表達(dá)。但長期大量應(yīng)用順鉑導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥后，順鉑反而會加速EMT進(jìn)程。如楊丞等［18］研究表明，長時間順鉑誘導(dǎo)的宮頸癌耐藥細(xì)胞株發(fā)生了EMT，可以解釋順鉑在初期應(yīng)用時療效很好，但一旦發(fā)生耐藥，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移依舊不可避免，因此抗腫瘤中藥和順鉑聯(lián)用就顯得非常必要。

近年研究中，NAVID等［5］用HSP90抑制劑處理黑色素瘤細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，HSP90 抑制劑可通過EMT 相關(guān)NF-κB信號通路調(diào)節(jié)HMGB2表達(dá)，提示HMGB2表達(dá)與黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生EMT 密切相關(guān)。YUAN 等［19］發(fā)現(xiàn)丹參酮可抑制胃癌細(xì)胞EMT 進(jìn)程，HMGB2 高表達(dá)可促發(fā)胃癌細(xì)胞EMT。HAN 等［20］發(fā)現(xiàn)HMGB2在結(jié)直腸癌中過表達(dá)，沉默長鏈非編碼RNACRCMSL可釋放HMGB2，并將其重新定位于細(xì)胞核與Oct4結(jié)合，進(jìn)而上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT 相關(guān)基因表達(dá)，故可通過促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞HMGB2 表達(dá)促發(fā)EMT。提示HMGB2可能是EMT的上游靶點。

綜上所述，DHA 可抑制肝癌細(xì)胞存活，并通過激活Caspase-3 誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，并通過下調(diào)HMGB2 表達(dá)抑制EMT 發(fā)生，從而阻礙肝癌細(xì)胞侵襲及遷移，在抗肝癌治療及控制肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面顯示出巨大潛力。DHA 對肝癌作用的其他機(jī)制、體內(nèi)作用情況如何以及治療劑量下的毒副作用仍需進(jìn)一步研究。