黃芩苷通過上調(diào)miR-126基因抑制乳腺癌細胞增殖①

王 婷 吳雙華 謝璨燦 唐新橋 羅 勇（株洲市中心醫(yī)院，株洲 412000）

乳腺癌現(xiàn)已成為全球女性最常見惡性腫瘤之一，已經(jīng)嚴重威脅到女性的身心健康。且其發(fā)病率與病死率在逐年上升，患者也呈年輕化發(fā)展的趨勢［1-5］。研究表明，乳腺癌的治療手段除了傳統(tǒng)的手術、放療、化療及內(nèi)分泌治療等方法外，免疫治療與基因治療也開始嶄露頭角［4-6］。其中，放、化療等對腫瘤細胞有殺傷力的同時，也會使正常細胞或組織損傷，進一步傷害到患者的機體功能，具有強烈的副作用［7］。與此同時，其高昂的治療經(jīng)費，也會對患者和社會造成巨大的經(jīng)濟負擔。因此，尋求一種有效、價廉、低毒的治療藥物已亟不可待。

黃芩苷（Baicalin）是黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）根中的一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗氧化等藥理作用，又以其毒性低、價格便宜、資源豐富等特點在一系列抗腫瘤藥物中脫穎而出。研究表明，黃芩苷在抗腫瘤活性上有重要作用。其具有誘導腫瘤細胞凋亡、分化、干擾信號傳導和抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的能力，從而抑制肺癌、肝癌、結(jié)腸癌及乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)展［1-5，8-10］。

乳腺癌治療不徹底，究其原因，主要在其極不可控地增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［11］。由此，防治乳腺癌細胞的惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移是提高乳腺癌治療效果的關鍵點。已有報道表明，黃芩苷可通過調(diào)節(jié)miRNA誘導乳腺癌細胞的凋亡［2-4］。

microRNA（miRNA）是一類內(nèi)生的、長度約為20～24 個核苷酸的小RNA，在細胞內(nèi)有多種調(diào)節(jié)作用。同一miRNA 可有多個靶基因，反之，同一基因也可由幾個miRNA 一起調(diào)控。如此，這樣可形成一個復雜的網(wǎng)絡，精細地調(diào)控機體的部分生命活動。miRNA 具有組織特異性、穩(wěn)定性等優(yōu)點。隨著技術手段的多樣化，越來越多的miRNA 被用來作為癌癥診斷的標志物［11-12］。

通過前期研究，本課題組發(fā)現(xiàn)黃芩苷可通過調(diào)節(jié)miRNA 來影響乳腺癌的發(fā)展［3］。同時，通過一系列實驗驗證篩選，本課題組發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-126 可以影響凋亡相關基因的表達，抑制乳腺癌細胞的凋亡［4］。已有研究證明miR-126 參與胃癌、口腔鱗癌、直腸癌和oxLDL 誘導血管平滑肌細胞的增殖和遷移[13-17]。近年來，多項研究也表明，miR-126 在乳腺癌的發(fā)展中起著重要作用［18-20］。

基于以上分析，本研究旨在通過分析miR-126對乳腺癌細胞（MCF-7）與正常乳腺細胞（MCF10A）的影響及miR-126過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和黃芩苷藥物處理后，體外觀測黃芩苷和miR-126 對MCF-7 細胞的影響，為黃芩苷治療乳腺癌的研究提供一個科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細胞（MCF-7）株、正常乳腺細胞（MCF10A）株購自中喬新舟。黃芩苷購自源葉生物（質(zhì)量分數(shù)98%）。質(zhì)粒miR-126 mimic 購自Honor-Gene。一抗TGF-β（21898-1-AP）、血管內(nèi)皮生長因子VEGF（19003-1-AP）、二抗anti-Rabbit（SA00001-2）均購自Proteintech。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8 細胞加藥培養(yǎng)后，更換完全培養(yǎng)基90μl。每孔被加入CCK-8 溶液10μl。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。酶標儀測定在450 nm 處的吸光度。實驗結(jié)果以OD值表征細胞活性大小。

1.2.2 MTT 法 MTT 法檢測細胞的生存率。取對數(shù)生長期的細胞，消化計數(shù)。以1×104個/孔密度接種于96 孔板內(nèi)，每孔100μl。各組均設4個復孔，培養(yǎng)至分組相應的時間后，每孔加入10 μl 5 mg/ml MTT。37℃、5%CO2繼續(xù)孵育4 h 后取出96 孔板。棄去含MTT 的培養(yǎng)基后，每孔加入150 μl DMSO。室溫緩慢搖晃10 min后于Bio-Tek酶標儀分析490 nm處吸光度（OD）值。

1.2.3 Transwell Transwell 檢測細胞侵襲。制備Transwell小室，冰上操作，Matrigel膠與無血清培養(yǎng)基按1∶2 稀釋。置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)60 min 使膠凝固。水化基底膜，制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度約為1×105個/ml。接種細胞：各吸取100 μl 加入到小室上室內(nèi)，下室加入含10%FBS 的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。染色：棄去小室內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS 洗2 遍。用濕棉簽擦盡上室面的Matrigel 和細胞，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗2遍，用0.5%結(jié)晶紫染色5 min，用清水洗3遍以上。細胞拍照：倒置顯微鏡下觀察，選取小室3個視野拍照。

Transwell 檢測細胞遷移。制備細胞懸液：培養(yǎng)的細胞用0.25%胰酶消化液消化，用無血清基礎培養(yǎng)基制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度約為1×105個/ml。接種細胞：各吸取100μl加入到小室上室內(nèi)，下室加入含10%FBS 的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。染色：棄去小室內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS 洗2 遍。用濕棉簽擦盡上室面的細胞。4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗2 遍。用0.5%結(jié)晶紫染色5 min，用清水洗3 遍以上。細胞拍照：倒置顯微鏡下觀察，每組選3 個視野進行拍照。

1.2.4 流式細胞術（FCM）FCM 檢測細胞凋亡率。已培養(yǎng)好的細胞用不含EDTA 的胰酶消化收集，PBS 清洗，收集1×105～2×105個細胞。加500 μl的Binding Buffer懸浮細胞。再依次加5μl Annexin VAPC、5 μl Propidium Iodide 混勻。室溫避光反應5～15 min。流式儀檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm，發(fā)射波長Em=530 nm。

1.2.5 Western blot 提取細胞蛋白，上樣，室溫電泳（恒壓78 V，約2.5 h）。冰水浴，轉(zhuǎn)膜（恒流300 mA，TGF-β 約60 min，VEGF 約60 min）。5%脫脂牛奶封閉2 h，4℃過夜。室溫下，一、二抗分別孵育1.5 h、1 h，每次孵育后用1×PBST 洗3 次，每次15 min。添加ECL工作液，暗室顯影曝光。

1.2.6 qRT-PCR 在NCBI 上搜索目的基因序列，采用Primer5 軟件設計引物。上海生工合成引物，H-miR-126-3p（5'-3'）：F-TCGTACCGTGAGTAATAATGCG，R-GCTGTCAACGATACGCTACGTAA,長 度75 bp；H-TGF-β（5'-3'）：F-AGCAACAATTCCTGGCGATACCTC，R-CAATTTCCCCTCCACGGCTCA，長度121 bp；H-VEGF（5'-3'）：F-TGCTCTACTTCCCCAAATCACT，R-ACTCACTTTGCCCCTGTCG，長度154 bp。提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄，采用qRT-PCR（30 μl 體系，預變性95℃10 min，變性95℃15 s，退火延伸60℃30 s）。

1.2.7 免疫熒光技術（IF）取出爬片，用4%多聚甲醛固定30 min。加0.3%曲拉通，37℃、30 min 通透，清洗，5%BSA 37℃封閉60 min。一抗（TGF-β、VEGF）4℃孵育過夜。二抗CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（SA00013-2），37℃孵育90 min。DAPI工作液37℃染核10 min，緩沖甘油封片。熒光顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理 用SPSS22.0 統(tǒng)計數(shù)據(jù)，Graphpad Prism8.0 處理統(tǒng)計圖。結(jié)果比較采用t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度黃芩苷對MCF-7 細胞的影響及其藥物濃度篩選 為探究黃芩苷在乳腺癌中的合適用藥濃度，對MCF-7 細胞進行不同濃度的黃芩苷（0、25、50、75、100μg/ml）加藥處理。細胞培養(yǎng)24 h 后，運用CCK-8 法檢測MCF-7 的細胞活性，結(jié)果顯示黃芩苷在0～50μg/ml的濃度范圍內(nèi)，MCF-7的細胞活性呈下降趨勢，其中用50μg/ml 黃芩苷處理后的細胞活性與75μg/ml、100μg/ml的接近，見圖1A。對此，接下來分別選擇以下3個濃度梯度的黃芩苷（0、50、100 μg/ml）做進一步處理，運用qRT-PCR、Western blot 及IF 檢測TGF-β、VEGF 在細胞內(nèi)的相對表達。其中TGF-β、VEGF 為惡性腫瘤的重要指標。qRTPCR、Western blot 及IF 結(jié)果表明，50 μg/ml 黃芩苷組相較0 μg/ml 黃芩苷組TGF-β 和VEGF 的表達顯著性降低，50μg/ml和100μg/ml 黃芩苷組則無明顯差異，見圖1B～E。由此可得出，在此次實驗中，50μg/ml為黃芩苷最適用藥濃度。

圖1 不同濃度黃芩苷對MCF-7 細胞的影響及其藥物濃度篩選（×200）Fig.1 Effects of different concentrations of baicalin on MCF-7 cells and screening of baicalin drug concentration（×200）

同時，以上實驗結(jié)果表明，黃芩苷對MCF-7 細胞的細胞活性有一定的抑制作用。且黃芩苷可在基因及蛋白水平上抑制TGF-β、VEGF 的表達。因此，本課題組推測，黃芩苷影響MCF-7 細胞的活性很可能是通過調(diào)節(jié)TGF-β、VEGF的表達實現(xiàn)。

2.2 miR-126 在MCF-7、MCF10A 細胞內(nèi)的表達為驗證miR-126 的表達，在MCF-7、MCF10A 這兩種細胞內(nèi)分別對miR-126、VEGF 的表達情況進行了檢測。qRT-PCR實驗結(jié)果表明在MCF-7細胞內(nèi)miR-126的表達顯著低于MCF10A，見圖2A。同時Western blot檢測VEGF 的相對表達量，VEGF 在MCF10A 內(nèi)低表達，MCF-7 內(nèi)顯著高表達，見圖2B、C。miR-126 與VEGF 在乳腺癌細胞中的表達呈負相關。因此推測，在MCF10A 細胞中，miR-126 高表達，減少VEGF的積累。而在MCF-7 細胞體內(nèi)，miR-126 低表達，對VEGF的抑制作用降低，促進血管生成以及乳腺癌的發(fā)展。

圖2 miR-126在MCF-7、MCF10A細胞內(nèi)的表達Fig.2 Expression of miR-126 in MCF-7 and MCF10A cells

2.3 過表達miR-126 對MCF-7、MCF10A 細胞的影響 為進一步探究miR-126對MCF-7的影響。在以上實驗基礎上，分別在正常乳腺細胞MCF10A 和乳腺癌細胞MCF-7內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-126過表達質(zhì)粒。運用qRT-PCR 驗證miR-126 的轉(zhuǎn)染效率，見圖3A。對MCF10A、MCF-7 細胞分別建立空白組（control）、空載組（NC-mimic）及過表達miR-126 組（miR-126 mimic）。利用MTT、Transwell 及FCM 等實驗技術手段檢測其對細胞增殖、侵襲遷移及凋亡等方面的影響。結(jié)果表明，MCF10A 的3 個組之間，生存率無明顯差異。MCF-7 的miR-126 mimic 組細胞生存率明顯低于control 組和NC-mimic 組，其中control 組和NC-mimic 組之間無明顯差異，MCF10A 組的細胞活性總體低于MCF-7 組，見圖3B；運用Transwell 檢測MCF-7 細胞的侵襲、遷移能力，miR-126 mimic 組與control 組、NC-mimic 組相比，其細胞侵襲率、遷移率都顯著性降低，見圖3C、D；用FCM 測MCF10A 和MCF-7 兩種細胞的凋亡率，miR-126 mimic 組在MCF-7 中細胞凋亡率較control 組和NC-mimic 組明顯增強，而MCF10A中3組無明顯變化，見圖3E。就整體實驗結(jié)果而言，在MCF10A 細胞中過表達miR-126，對其狀態(tài)無明顯影響。不同的是，在對MCF-7細胞進行過表達miR-126 處理后，不僅MCF-7 細胞的細胞活性受到抑制，細胞的侵襲率、遷移率都有所降低。而與此相反的是MCF-7 細胞的凋亡率呈上升趨勢。這進一步證明了miR-126在乳腺癌細胞發(fā)展中有重要的調(diào)節(jié)作用。

2.4 黃芩苷調(diào)節(jié)miR-126 影響MCF-7 細胞的增殖 經(jīng)上述實驗，篩選出黃芩苷的最佳用藥濃度為50 μg/ml。將MCF-7 細胞分為空白組（control 組）、空載組（NC-mimic 組）、過表達miR-126（miR-126 mimic 組）、空載+50 μg/ml 黃芩苷（Baicalin+NC 組）和過表達miR-126+50 μg/ml 的黃芩苷組（Baicalin+miR-126組）。MTT的結(jié)果表明，在上述5個組別中，Baicalin+miR-126組的細胞活力最低，miR-126 mimic組和Baicalin+NC 組較control組都具有顯著性差異，而miR-126 mimic組和Baicalin+NC 組間無顯著性差異，見圖4A。這表明黃芩苷和miR-126 對MCF-7 細胞的增殖有抑制作用。同時，qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，Baicalin+NC 組與control組相比較，miR-126的相對表達量顯著升高，且Baicalin+miR-126 組也顯著高于miR-126 mimic 組，見圖4B。這表明Baicalin 可在MCF-7細胞中調(diào)節(jié)miR-126的表達。為進一步說明黃芩苷及miR-126 在乳腺癌細胞中的調(diào)節(jié)作用，運用qRT-PCR、Western blot 檢測指標TGF-β 和VEGF 分別在基因、蛋白水平上的相對表達，見圖4C、D。結(jié)果顯示，在TGF-β、VEGF基因及蛋白水平上，Baicalin+miR-126 組較其他4 組均顯著低表達。miR-126 mimic 組與baicalin+NC 組相較control 組為低表達，而兩組間無明顯差異。用FCM 檢測MCF-7細胞的凋亡情況，見圖4E。結(jié)果表明miR-126 mimic組、Baicalin+NC 組相較于control 組，MCF-7 細胞凋亡情況呈上升趨勢。與此同時，Baicalin+miR-126組與其他組相比較，MCF-7 細胞的凋亡率顯著性升高。就上述實驗結(jié)果而言，發(fā)現(xiàn)Baicalin+miR-126組較其他幾組在抑制細胞活性、降低TGF-β 和VEGF 的表達以及促進細胞凋亡中具有顯著性差異。由此，推測黃芩苷可與miR-126 協(xié)同作用于MCF-7 細胞，降低MCF-7 細胞的增殖。FCM 的實驗結(jié)果從側(cè)面驗證了黃芩苷可協(xié)同miR-126 上調(diào)MCF-7細胞的凋亡率，抑制其增殖。結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)黃芩苷可抑制MCF-7 細胞的增殖，其一部分機制可能是通過上調(diào)miR-126。

圖4 黃芩苷調(diào)節(jié)miR-126影響MCF-7細胞增殖Fig.4 Baicalin regulates miR-126 to effect proliferation of MCF-7 cells

3 討論

黃芩苷是一種黃酮類化合物，具有多種藥理活性。據(jù)報道，黃芩苷可通過調(diào)節(jié)信號通路來緩解炎癥和抑制腫瘤的作用。文獻表明，黃芩苷可通過AKT 調(diào)節(jié)Nrf2、NF-κB 和FoxO1 可緩解慢性胃炎和改善神經(jīng)炎癥，發(fā)揮神經(jīng)保護的作用［21-23］。DAI等［24］在研究由飲食引發(fā)的肥胖和肝脂肪變性中也發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能通過激活CPT1，達到治療的效果。

多項研究表明，黃芩苷可作為治療乳腺癌的一種潛在高效的天然藥物。ZHOU 等［25］研究表明，黃芩苷可以通過調(diào)節(jié)β-catenin 信號逆轉(zhuǎn)EMT，從而抑制具有高度侵襲性的乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移。GAO 等［26］研究表明，黃芩苷可以通過抑制IκB 激酶的激活和NF-κB的活化，從而抑制乳腺癌的發(fā)展。最近，有研究報道黃芩苷在骨性乳腺癌中也有治療作用，黃芩苷通過誘導細胞凋亡抑制乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移性生長來發(fā)揮對骨性乳腺癌的骨保護和抗腫瘤作用［27］。

另外，有相關文獻報道，黃芩苷可以通過靶向miRNA調(diào)節(jié)下游基因表達來治療癌癥。DUAN等［28］在研究黃芩苷對乳腺癌的治療時，表明黃芩苷可以通過調(diào)節(jié)miR-338-3p 和MORC4 來抑制乳腺癌細胞的活力，促進癌細胞的凋亡。這為研究黃芩苷的治療機制提供了新的思路。同時，前期研究中也表明，黃芩苷可通過上調(diào)miR-126促進乳腺癌的凋亡。

現(xiàn)有的技術手段下，miR-126 雖然在不同類型的癌癥中所承擔的角色還存在一定的爭議［11，13］。公認的是miR-126在腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移中扮演重要的角色。miR-126 可以通過復雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡靶向調(diào)控基因的表達，改變腫瘤的生長環(huán)境，參與癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移。在胃癌、肺癌、直腸癌及口腔癌等惡性腫瘤中miR-126 明顯低表達，它與癌細胞的高增殖活性、轉(zhuǎn)移能力以及腫瘤間質(zhì)血管增殖旺盛等現(xiàn)象密切相關［11，13-17］。同時，有研究者發(fā)現(xiàn)，miR-126 也可作為慢性粒細胞性白血病的一個新的治療靶標。從EC 轉(zhuǎn)運到LSC，miR-126 可以促進CML、LSC 的靜態(tài)及白血病的移植［29-31］。在食管癌中，miR-126通過抑制VEGF的表達來調(diào)控食管癌細胞的增殖［32］。與此相似的是，在不飽和脂肪酸對大腸癌細胞的作用研究中，miR-126通過抑制VEGF的蛋白表達，進而影響大腸癌的發(fā)展［33］。以上文獻表明，miR-126 通過調(diào)節(jié)VEGF 的表達，從而抑制血管生成和癌細胞增殖。這與研究結(jié)果一致，miR-126抑制了VEGF的表達。MONACO等［34］在研究惡性間皮瘤的報道中同樣表明，miR-126 抑制了細胞生長和血管生成。LI 等［35］在關于改善動脈粥樣硬化的報道中，上調(diào)miR-126 可降低VEGF 表達及抑制細胞活力、遷移。以上實驗均從側(cè)面驗證了本次實驗結(jié)果的準確性。

另外，發(fā)現(xiàn)對比單一處理，兩種處理（黃芩苷與miR-126 過表達）同時進行時，MCF-7 細胞的活性及凋亡率都具有顯著性差異。對此，推測黃芩苷影響MCF-7 細胞，其部分機制可能是通過上調(diào)miR-126。且兩者可協(xié)同作用于MCF-7細胞抑制增殖。

綜上所述，黃芩苷可以抑制乳腺癌細胞的增殖，其部分機制可能是通過上調(diào)miR-126基因，降低VEGF 的表達，這將為乳腺癌的治療研究提供一個科學依據(jù)。