小膠質(zhì)細胞介導的TRPV1 在小鼠缺血性腦卒中后抑郁樣行為中的作用和機制①

劉 丹 方天賜 李明玥 宋遠見 王玉蘭（徐州醫(yī)科大學人體解剖學教研室，徐州 221000）

缺血性卒中（ischemic stroke，IS）是指由于各種突發(fā)原因引起的大腦局部血供障礙，造成組織缺血性壞死，導致相應(yīng)的階段性或永久性的神經(jīng)功能損傷的一種疾病。近年來，IS 的發(fā)病率逐年增加，其高致死率和高致殘率已經(jīng)成為全球主要的公共衛(wèi)生問題［1］。腦缺血發(fā)生后，小膠質(zhì)細胞被迅速激活，分泌各種蛋白水解酶和炎癥因子，如IL-1β，從而導致腦損傷［2］。臨床研究表明，約有31%的IS 患者經(jīng)歷臨床抑郁癥［3］。腦血管疾病和抑郁癥的機制是相互交錯的［4］。抑郁癥患者具有更高水平的炎癥標志物和激活的小膠質(zhì)細胞，因此小膠質(zhì)細胞引起的神經(jīng)炎癥可能是造成抑郁癥的原因之一，對于抗炎藥物的使用在一定程度上可緩解抑郁癥狀［5］。

辣椒素受體1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）是TRP 通道家族中最具特征的成員之一，可被多種物理或化學刺激激活。TRPV1 在嚙齒動物腦中廣泛表達，包括海馬、皮質(zhì)和杏仁核［6］。TRPV1 可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細胞的活性來介導神經(jīng)炎癥，在受到刺激后TRPV1 被激活，改變小膠質(zhì)細胞的形態(tài)和功能，從而清除細胞碎片，但如果沒有有效的限制，可能會導致神經(jīng)元功能失調(diào)并誘發(fā)持續(xù)性炎癥［7］。和周圍神經(jīng)系統(tǒng)相比，TRPV1 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用仍知之甚少［6］。部分研究表明，TRPV1 在缺血性腦損傷中起重要作用，可能是一個潛在靶標［8］。然而TRPV1 對IS 后抑郁的作用尚不清楚，因此本研究旨在探討TRPV1對IS后抑郁樣行為的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡雄性C57BL/6J小鼠45只，體質(zhì)量22～24 g，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物許可證號：SCXK（魯）20190003。所有動物均在12 h 光照/12 h 黑暗循環(huán)下飼養(yǎng)，溫度控制在23℃左右，濕度保持在60%～65%。

1.1.2 主要試劑 Capsazepine（Sigma 公司）；Iba1抗體（Wako公司/Santa cruz公司）；TRPV1抗體（Novus公司）；Goat Anti-Rabbit IgG H&L、Goat Anti-Mouse IgG H&L（Abcam公司）；DAPI染色試劑、蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），IL-1β抗體、β-actin抗體（Proteintech公司）。

1.2 方法

1.2.1 大腦中動脈阻塞（MCAO）模型 采用改良的線栓法構(gòu)建MCAO 模型：異氟烷持續(xù)麻醉小鼠后仰臥位固定。沿頸正中線切開皮膚，充分暴露并分離右側(cè)的頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈。結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈，于頸外動脈結(jié)扎處以上插入線栓并通過頸內(nèi)動脈最終進入大腦中動脈，固定線栓。缺血1 h 后，緩慢退出線栓，恢復大腦血供，縫合并消毒傷口。Sham 組制備前期步驟同上，但不插入線栓。

1.2.2 分組與給藥 將小鼠隨機分為3組：假手術(shù)組（sham），腦缺血再灌注組（ischemia/reperfusion，I/R），腦缺血再灌注+TRPV1 抑制劑capsazepine 組（I/R+CPZ），15只/組。

將小鼠固定于腦立體定位儀上，以前囟為零點在前囟后0.7 mm、右側(cè)1.0 mm 和深2.5 mm 處插入微量注射泵，于5 min內(nèi)緩慢勻速給藥。Capsazepine溶于2%DMSO+10%Tween80 生理鹽水，每只小鼠的劑量為7.5μg/3μl。

1.2.3 強迫游泳實驗 將小鼠放入透明玻璃圓筒中（12 cm×25 cm），筒內(nèi)水深約15 cm，水溫為25℃。累計5 min 內(nèi)小鼠的不動時間，當小鼠停止掙扎，漂浮在水中不動，或做一些輕微動作保持頭部浮在水面上的時間視為不動時間［9］。

1.2.4 懸尾實驗 用繩和膠帶將小鼠倒掛于掛鉤上，頭朝下距地面約5 cm，累計記錄5 min 內(nèi)小鼠放棄掙扎靜止不動的時間［10］。

1.2.5 免疫熒光染色 取出腦組織冰凍切片，室溫下復溫30 min，PBS清洗5 min×3次，BSA室溫封閉2 h，滴加一抗Iba1（1∶1 000）、TRPV1（1∶400），4℃孵育過夜，PBS清洗5 min×3次，避光加入羊抗兔及羊抗鼠二抗（1∶600），室溫2 h，PBS 清洗5 min×3 次后加入DAPI 染色試劑，室溫5 min，PBS 清洗5 min×3 次，防熒光淬滅劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并攝片。

1.2.6 HE 染色 取出腦片室溫下復溫30 min，PBS 清洗2 min，蘇木素染液浸泡8 min，自來水沖洗5 min，伊紅染液浸泡15 s，自來水沖洗5 min，梯度乙醇脫色，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片，顯微鏡觀察并攝片。

1.2.7 免疫印跡 提取各組小鼠腦半暗帶組織，BCA 法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE 凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)30 min，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗兔抗IL-1β（1∶800），4℃孵育過夜。1×TBST 清洗后加入兔二抗（1∶10 000），室溫避光孵育2 h，采用Odissey 遠紅外顯像系統(tǒng)對各組條帶結(jié)果進行掃描。使用Image J軟件對條帶進行蛋白定量分析，各組蛋白定量以目的蛋白灰度值與內(nèi)參（β-actin）灰度值比值進行統(tǒng)計學分析，實驗重復3次，取均值。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以表示，所有實驗數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以α=0.05 為檢驗標準，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制TRPV1 對腦卒中后小鼠抑郁樣行為的影響 強迫游泳實驗結(jié)果和懸尾實驗結(jié)果顯示：與sham 組相比，I/R 組小鼠強迫游泳靜止時間及懸尾靜止時間明顯延長（P＜0.001）。而在側(cè)腦室給予TRPV1 抑制劑capsazepine 后，在強迫游泳和懸尾實驗中，與I/R 組相比，I/R+CPZ 組的靜止時間顯著縮短（P＜0.001）。表明抑制TRPV1對小鼠腦卒中后的抑郁樣行為有明顯改善（表1）。

表1 強迫游泳和懸尾實驗小鼠的不動時間（）Tab.1 Immobility time of mice in forced swimming and tail suspension experiments（）

表1 強迫游泳和懸尾實驗小鼠的不動時間（）Tab.1 Immobility time of mice in forced swimming and tail suspension experiments（）

Note：I/R vs sham，1）P＜0.001；I/R+CPZ vs I/R，2）P＜0.001.

2.2 抑制TRPV1 對腦卒中后小鼠杏仁核區(qū)病理影響 HE染色結(jié)果顯示：I/R組可見細胞數(shù)量減少，排列疏松散亂，周圍出現(xiàn)水腫間隙部分細胞核固縮深染，而CPZ 處理之后，I/R+CPZ 組細胞形態(tài)基本恢復（圖1）。

圖1 Capsazepine對杏仁核區(qū)病理影響（20 μm）Fig.1 Effect of Capsazepine on pathology of amygdala（20 μm）

2.3 TRPV1 在杏仁核小膠質(zhì)細胞中的表達 免疫熒光觀察結(jié)果顯示：TRPV1 和小膠質(zhì)細胞間存在明顯的空間共定位，表明小膠質(zhì)細胞中有TRPV1 的表達（圖2）。

圖2 TRPV1在小膠質(zhì)細胞中的表達（20 μm）Fig.2 TRPV1 expression in microglia（20 μm）

2.4 抑制TRPV1 對腦卒中后杏仁核小膠質(zhì)細胞激活的影響 免疫熒光觀察結(jié)果顯示：與sham 組（5.667±1.155）相比，I/R 組（22.670±2.309）杏仁核小膠質(zhì)細胞標志物Iba-1 的陽性個數(shù)明顯增加（P＜0.001），突起減少，胞體增大，呈現(xiàn)出顯著的激活狀態(tài)；而經(jīng)過CPZ（10.330±1.528）處理之后，小膠質(zhì)細胞激活數(shù)量明顯減少（P＜0.001，圖3）。

圖3 Capsazepine對小膠質(zhì)細胞激活的影響（20 μm）Fig.3 Effect of Capsazepine on microglial activation（20 μm）

2.5 抑制TRPV1 對IL-1β 表達的影響 免疫印跡檢測結(jié)果顯示：I/R 組小鼠腦部炎癥因子IL-1β 的蛋白表達量（3.022±0.237 4）相較sham 組（1.988±0.159 2）明顯上升（P＜0.01），而在TRPV1 被抑制后，I/R+CPZ 組（2.341±0.287 2）IL-1β 表達量明顯下降（P＜0.05，圖4）。

圖4 Capsazepine對IL-1β表達的影響Fig.4 Effect of Capsazepine on IL-1β expression

3 討論

TRPV1 與多個器官或系統(tǒng)中的免疫過程和炎癥通路密切相關(guān)［11］。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐髓樣細胞，其活性同樣受到TRPV1 的調(diào)節(jié)。在外周，TRPV1 調(diào)節(jié)免疫細胞遷移進入腦實質(zhì)，從而促進炎癥反應(yīng)。研究表明，TRPV1通過增強IL-1β和IL-6 的作用，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮促炎作用［12］。本實驗主要研究抑制TRPV1 后是否能減少炎癥反應(yīng)并進一步改善小鼠的抑郁樣行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室注射TRPV1 抑制劑Capsazepine 后，小鼠的強迫游泳和懸尾不動時間明顯減少，表明其抑郁樣行為有一定程度的改善。此外，研究還發(fā)現(xiàn)TRPV1 在小膠質(zhì)細胞中存在表達，且Capsazepine 能減少杏仁核區(qū)域病理性損傷和小膠質(zhì)細胞的激活以及IL-1β 的表達，證明抑制TRPV1 能減輕IS 后的炎癥反應(yīng)。

多項研究表明，炎癥和抑郁有相關(guān)性，中風后抑郁的患者早期即出現(xiàn)炎癥標志物，促炎細胞因子及促炎/抗炎比率的增加和補體表達的降低［13］。KREISEL 等［14］發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥亞胺丙嗪能夠緩解應(yīng)激誘導的小膠質(zhì)細胞的數(shù)量及形態(tài)變化，減輕抑郁樣行為，表明小膠質(zhì)細胞也與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。最近的數(shù)據(jù)同樣表明中風后抑郁涉及炎癥、氧化應(yīng)激和免疫機制［15］。本研究結(jié)果也進一步說明了抑制TRPV1 可能是通過對IS 后炎癥的改善來對小鼠的抑郁樣行為起到保護作用。前期研究大多表明炎癥在中風后抑郁中的作用，但ORMSTAD等［16］的數(shù)據(jù)表明，在卒中后的6、12 和18 個月炎癥相關(guān)因子和抑郁之間并不存在關(guān)聯(lián)，這可能是由于樣本量較少，而測量的炎癥因子數(shù)量過多所致。

綜上所述，本研究顯示，抑制TRPV1 可能通過影響小膠質(zhì)細胞進而減輕炎癥反應(yīng)，從而改善IS 后的抑郁樣行為。因此TRPV1 在卒中后抑郁的治療中可能是一個關(guān)鍵性靶點。