JAK/STAT 信號(hào)通路在小鼠心肌梗死發(fā)病中的作用及對(duì)NF-κB、TNF-α表達(dá)的影響①

盧世文 余麗菲（廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，南寧 530007）

心肌梗死是由冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性供血、供氧不足而導(dǎo)致的心肌組織細(xì)胞壞死癥狀，具有發(fā)病率高、病死率高、病情進(jìn)展快和預(yù)后差的特點(diǎn)，主要臨床表現(xiàn)為胸骨后劇烈持久疼痛，可能會(huì)并發(fā)心律失常［1-2］。據(jù)世衛(wèi)組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，老年人為心肌梗死高發(fā)群體，近年來我國(guó)人口老齡化現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重，心肌梗死新增病例逐年上升，但是心肌梗死發(fā)病機(jī)制尚未研究透徹［3］。JAK/STAT 信號(hào)通路是重要的細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)途徑，能夠?qū)⒓?xì)胞膜感受到的刺激信號(hào)向細(xì)胞核傳遞，對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)等產(chǎn)生影響［4］。XIN 等［5］研究表示，JAK/STAT 信號(hào)通路在心肌梗死中起重要作用，靶向調(diào)控JAK/STAT 信號(hào)通路，能夠有效抑制心肌梗死后心肌組織細(xì)胞凋亡。本研究建立心肌梗死小鼠模型，并靶向調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路，觀察其效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取30 只SD 健康雄性小鼠，由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，5～7 周齡，平均（6.0±0.8）周齡；體質(zhì)量20～28 g，平均體質(zhì)量（24.1±3.2）g。在相對(duì)濕度50%～55%、溫度（24.1±2.1）℃的環(huán)境中喂養(yǎng)小鼠1周，光照12 h/d。本研究獲廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 兔抗大鼠JAK1、JAK2 抗體（Hyclone 公 司）；兔抗小鼠STAT3、STAT5 抗體（Invitrogen 公司）；大鼠抗小鼠NF-κB 抗體（Gibco公司）；小鼠抗大鼠TNF-α抗體（BD公司）；酶聯(lián)免疫試劑盒（北京維德維康生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組 隨機(jī)選取10 只小鼠為正常組，不做干預(yù)。其余20 只小鼠建立心肌梗死模型：麻醉干預(yù)后對(duì)小鼠背部進(jìn)行消毒，固定后將喉管切開，連接呼吸機(jī)，使用剪刀將左側(cè)第3、4段肋間皮膚剪開，打開小鼠胸腔，使小鼠心臟組織暴露于術(shù)野之中。剪開心包膜后對(duì)冠狀動(dòng)脈前支進(jìn)行穿線結(jié)扎，之后清創(chuàng)縫合。所有小鼠進(jìn)行心電圖檢查，ST段上抬至弓背向上為建模成功。建模成功18只，隨機(jī)分為心肌梗死組、阻斷干預(yù)組各9 只。阻斷干預(yù)組小鼠使用5 mg/kg AG490 溶液灌胃，正常組、心肌梗死組小鼠使用等量生理鹽水進(jìn)行灌胃。所有小鼠均干預(yù)4周。

1.2.2 心功能指標(biāo)檢測(cè) 對(duì)小鼠麻醉處理后，左傾30°仰臥固定，剃毛后將超聲探頭置于左胸骨，與中線夾角20°，觀察記錄各組小鼠舒張末期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall diastolic dimension，LVPWDd）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDd）、舒張末期室間隔厚度（left ventricular end-systolic diameter，LVESd）水平。

1.2.3 心臟、左心室重量指數(shù)檢測(cè) 對(duì)所有小鼠體質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，之后對(duì)3組小鼠進(jìn)行全麻處理，采用斷頭法處死，將小鼠心臟組織取出，并將心腔內(nèi)殘留血液清除，稱取小鼠心臟、左心室重量，計(jì)算心臟、左心室重量指數(shù)。

1.2.4 HE染色處理 取小鼠心臟，固定在4%甲醛中完全浸泡，24 h 后行常規(guī)石蠟包埋及連續(xù)切片。首先將切片烤干后進(jìn)行脫蠟處理，之后順序置于不同濃度的乙醇中各復(fù)脫水3 min。使用蘇木精染色15 min 后清洗3 次，鹽酸乙醇分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，乙醇脫水處理后進(jìn)行脫蠟，封片后使用顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)JAK/STAT 通路蛋白表達(dá) 取RIPA 裂解液，1.5℃PMSF 冰中孵育30 min，1 500 r/min離心15 min，取上清。每個(gè)樣品取15 g 蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)入PVDF 膜，5%脫脂牛奶常溫下密封2 h。加入抗體過夜。取出后TBST液沖洗，加入二抗，60 min 后清洗、顯色，對(duì)JAK/STAT通路蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 TUNEL 法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況 常溫下使用20μg/ml蛋白酶K培養(yǎng)0.5 h后去除蛋白，清洗后加入100 μl 平衡緩沖液，室內(nèi)平衡10 min，滴入100 μl TdT 酶反應(yīng)液，避光、室溫環(huán)境中孵育1 h 后加入100μl SSC 溶液，靜置20 min后清洗3次，DAPI復(fù)染，避光培養(yǎng)10 min 后清洗、封片觀察。DAPI 復(fù)染細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈綠色，每切片取3個(gè)視野進(jìn)行觀察、計(jì)算細(xì)胞凋亡率和平均值。

1.2.7 ELISA 檢測(cè)NF-κB、TNF-α 水平 標(biāo)記酶標(biāo)板，制作標(biāo)準(zhǔn)品，然后取出試劑盒，以1∶2 的稀釋液稀釋樣品；在反應(yīng)孔上100μl/孔依次加入稀釋好的待測(cè)血清和標(biāo)準(zhǔn)品，放置37℃恒溫孵育箱中濕育2 h；用專用的洗滌液將反應(yīng)板清洗3 次，加入抗體工作液（1∶100 稀釋）100 μl/孔，放于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續(xù)清洗反應(yīng)板4 次，在反應(yīng)孔內(nèi)加入TMB 溶液100 μl/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min，在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液100μl/孔終止反應(yīng)，450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，反應(yīng)顏色深淺與NF-κB、TNF-α水平成正比，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NF-κB、TNF-α水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以描述，多組對(duì)比行F值檢驗(yàn)，組間對(duì)比行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組小鼠心臟組織切片、心肌梗死區(qū)周邊區(qū)域HE 染色圖 如圖1所示，正常組小鼠無心肌梗死狀況，心肌梗死組小鼠心肌梗死面積較大，與心肌梗死組相比，阻斷干預(yù)組小鼠心肌梗死面積明顯縮小。如圖2所示，正常組小鼠心肌組織細(xì)胞清晰，心肌組織細(xì)胞排列規(guī)則緊密；心肌梗死組小鼠心肌組織細(xì)胞排列雜亂，出現(xiàn)較多膠原纖維，心肌橫紋破壞嚴(yán)重，伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；阻斷干預(yù)組小鼠心肌組織細(xì)胞形態(tài)較為完整，排列較為規(guī)則，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況明顯減輕。

圖2 3組小鼠心肌梗死區(qū)周邊區(qū)域HE染色（×400）Fig.2 HE staining of periphery of myocardial infarction in three groups of mice（×400）

2.2 3組小鼠各項(xiàng)心功能指標(biāo)水平比較 如表1所示，正常組小鼠心功能指標(biāo)均低于其他兩組，且與心肌梗死組比較，阻斷干預(yù)組LVPWDd、IVSDd、LVEDd、LVESd水平較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＜0.05）。

表1 3組小鼠心功能水平比較（）Tab.1 Comparison of cardiac function levels among three groups of mice（）

表1 3組小鼠心功能水平比較（）Tab.1 Comparison of cardiac function levels among three groups of mice（）

Note：Compared with normal group，1）P＜0.05；compared with myocardial infarction group，2）P＜0.05.

2.3 3 組小鼠心臟、左心室重量指數(shù)比較 如表2所示，正常組小鼠心臟、左心室重量及心臟、左心室重量指數(shù)均低于心肌梗死組和阻斷干預(yù)組，且阻斷干預(yù)組小鼠心臟、左心室重量及心臟、左心室重量指數(shù)均低于心肌梗死組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 3組小鼠心臟、左心室重量指數(shù)比較（）Tab.2 Comparison of heart and left ventricular weight index in three groups of mice（）

表2 3組小鼠心臟、左心室重量指數(shù)比較（）Tab.2 Comparison of heart and left ventricular weight index in three groups of mice（）

Note：Compared with normal group，1）P＜0.05；compared with myocardial infarction group，2）P＜0.05.

2.4 3 組小鼠JAK/STAT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 如表3、圖3 所示，正常組小鼠JAK1、JAK2、STAT3、STAT5 蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于心肌梗死組和阻斷干預(yù)組，阻斷干預(yù)組小鼠JAK1、JAK2、STAT3、STAT5 蛋白表達(dá)均低于心肌梗死組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 3組小鼠JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)對(duì)比（）Tab.3 Comparison of JAK/STAT signaling pathway-related protein expression in three groups of mice（）

表3 3組小鼠JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)對(duì)比（）Tab.3 Comparison of JAK/STAT signaling pathway-related protein expression in three groups of mice（）

Note：Compared with normal group，1）P＜0.05；compared with myocardial infarction group，2）P＜0.05.

圖3 JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.3 JAK/STAT signaling pathway-related proteins expressions

2.5 3 組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較 如表4 所示，心肌梗死組小鼠各時(shí)間點(diǎn)心肌細(xì)胞凋亡率均高于正常組，阻斷干預(yù)組小鼠各時(shí)間點(diǎn)心肌細(xì)胞凋亡率均低于心肌梗死組，高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 3組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況對(duì)比（xˉ±s，%）Tab.4 Comparison of cardiomyocyte apoptosis in three groups of mice（xˉ±s，%）

2.6 3 組小鼠心肌組織NF-κB、TNF-α 表達(dá)水平比較 如表5所示，正常組小鼠心肌組織NF-κB、TNF-α表達(dá)水平均低于心肌梗死組和阻斷干預(yù)組，阻斷干預(yù)組小鼠心肌組織NF-κB、TNF-α 表達(dá)水平均低于心肌梗死組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表5 3組小鼠心肌組織NF-κB、TNF-α表達(dá)水平比較（）Tab.5 Comparison of expression levels of NF-κB and TNF-α in myocardial tissue of three groups of mice（）

表5 3組小鼠心肌組織NF-κB、TNF-α表達(dá)水平比較（）Tab.5 Comparison of expression levels of NF-κB and TNF-α in myocardial tissue of three groups of mice（）

Note：Compared with normal group，1）P＜0.05；compared with myocardial infarction group，2）P＜0.05.

3 討論

大量臨床研究表明，心肌梗死癥狀的發(fā)生發(fā)展伴隨心功能異常及心室重構(gòu)［6-7］。LVPWDd、IVSDd、LVEDd、LVESd 是常用的評(píng)價(jià)心功能的指標(biāo)［8］。本研究顯示，心肌梗死模型小鼠心功能出現(xiàn)明顯異常，心臟、左心室重量指數(shù)較大，上述結(jié)果提示心肌梗死小鼠模型制備成功，與臨床心肌梗死病變的基本特征一致。心肌梗死發(fā)生后，心肌細(xì)胞迅速凋亡壞死，刺激NF-κB 活化并快速?gòu)募?xì)胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與特異的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)如TNF-α等多種活性細(xì)胞因子釋放，增高的TNF-α 通過第二信使途徑反饋性地刺激NF-κB，在梗死區(qū)爆發(fā)炎癥反應(yīng)，加重缺血心肌部位的損傷［9-15］。如本研究結(jié)果所示，HE 顯示心肌梗死組小鼠心肌組織細(xì)胞排列雜亂，出現(xiàn)較多膠原纖維，心肌橫紋破壞嚴(yán)重，伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌梗死組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率高于正常組，心肌組織NF-κB、TNF-α表達(dá)水平低于正常組小鼠。

近年研究表明，作為細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路JAK/STAT能夠?qū)C(jī)體炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等進(jìn)行調(diào)控。激活的JAK 可將受體特定的絡(luò)氨酸殘基磷酸化，成為STAT 與細(xì)胞內(nèi)其他信號(hào)分子的結(jié)合位點(diǎn)，并將集合在該位點(diǎn)的STAT 磷酸化激活，活化的STAT與受體形成聚合體并進(jìn)入到細(xì)胞核，啟動(dòng)對(duì)應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄。有學(xué)者認(rèn)為JAK/STAT 信號(hào)通路參與血管生成、心血管疾病的發(fā)生發(fā)展［16］。EID 等［17］在研究中指出JAK/STAT 信號(hào)通路參與心肌梗死后心室重構(gòu)，上調(diào)心肌梗死后的損傷因子表達(dá)，上調(diào)的損傷因子又可提高JAK/STAT信號(hào)通路活性，靶向阻斷JAK/STAT 信號(hào)通路能夠起到心肌保護(hù)作用。如本研究結(jié)果顯示，心肌梗死小鼠心肌的JAK1、JAK2、STAT3、STAT5蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增高，提示JAK/STAT信號(hào)通路參與心肌梗死病變過程，與上述文獻(xiàn)一致。如進(jìn)一步使用JAK/STAT 信號(hào)通路特異性阻斷劑AG490 進(jìn)行干預(yù)，心肌梗死小鼠心功能指標(biāo)水平出現(xiàn)下降，心臟、左心室重量指數(shù)出現(xiàn)下降，提示對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路進(jìn)行阻斷后，心肌梗死小鼠心功能、左室重構(gòu)、心肌炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病變均得到明顯改善。同時(shí)特異性阻斷劑AG490干預(yù)可顯著降低心肌梗死模型小鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率、心肌NF-κB與TNF-α 表達(dá)、心肌JAK1、JAK2、STAT3、STAT5 蛋白表達(dá)，上述結(jié)果證實(shí)心肌梗死的炎癥反應(yīng)依賴于JAK/STAT 信號(hào)通路活性，阻斷JAK/STAT 信號(hào)通路能夠緩解心肌梗死小鼠心肌組織炎癥反應(yīng)，進(jìn)而緩解心室重構(gòu)，改善心肌梗死癥狀，其可能原因在于TNF-α mRNA 啟動(dòng)子含有STAT 結(jié)合位點(diǎn)，AG490干預(yù)降低STAT 活化或活性，進(jìn)而降低TNF-α 轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步降低NF-κB激活［14，18-20］。

綜上所述，小鼠心肌梗死發(fā)病后心功能及心臟、左心室重量指數(shù)出現(xiàn)異常，使用AG490 阻斷JAK/STAT信號(hào)通路后，小鼠心功能及心肌細(xì)胞凋亡情況得到改善，心臟、左心室重量指數(shù)下降，心肌組織炎癥反應(yīng)得到抑制。JAK/STAT 信號(hào)通路在心肌梗死的炎癥反應(yīng)、心室重構(gòu)等方面起關(guān)鍵作用，抑制JAK/STAT 信號(hào)通路活性可能是心肌梗死治療的潛在靶點(diǎn)。